细胞培养方法的问答（1）

1、肿瘤细胞培养问题：

问：我养的肿瘤细胞，传多少代以后不能用、需要重新复苏新的呢？我总觉得细胞形态不好，但长的还挺快！

答：初代培养的细胞在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10-50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止。组织和细胞在培养中生命期如何，这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。

如人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30-50代，人胚肺成纤维细胞可传50代±10代，人胚肾只有8-10代，人胚神经胶质细胞15-30代等。而肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常能传几十代或百代以上，具有永生性及异体接种致瘤性等特点，但随着传代次数的增多，细胞增殖也会逐渐缓慢，形态亦会变化。另外，看看你的培养条件是否严格按照该肿瘤细胞的要求进行，条件变了细胞亦会适应新的环境而发生改变。可试试用质量好的进口血清培养，看细胞长的如何。

2、HepG3B细胞问题：

问：HepG3B细胞是一种什么细胞？与HepG2细胞有何区别？听说是本身就有乙肝病毒感染的，请问病毒的基因型和血清型是什么？能分泌表面抗原和e抗原吗？需要加G418吗？

答：HEP-3B human hepatocellular carcinoma established from the tumor tissue of an 8-year-old black boy in 1976;description: cells contain integrated hepatitis B virus genome;cells were described to produce a variety of proteins,e.g. alpha-fetoprotein, albumin,transferrin,alpha2-macroglobulin,alpha1-antitrypsin,haptoglobin and others;patented cell line;this cell line has been assigned by the ZKBS (German Central Commission for Biological Safety)to risk category 2 confirmed as human with IEF of AST, MDH,PEP B.

Viruses:ELISA:reverse transcriptase negative;PCR:EBV-,HCV-,HIV-,HTLV-I/II-.

HepG2普通的肝癌细胞，没有HBV整合。HEP-3B 培养不用加G418。

3、顺铂的保存问题：

问：从肿瘤医院买来的顺铂注射液，拿来的时候没有避光，大约有2小时，我想请教一下：不避光2小时对顺铂影响大吗？还可以用吗？还有，我应该怎么保存，4度避光保存，对吗？利用顺铂研究细胞凋亡，应该怎么配制溶液，配好可以维持多长时间不失效？

答：不避光2小时对顺铂影响不大，可放到4度避光保存。可以用生理盐水配制成10-40μg(具体视实验而定)，可以放至少半年左右不失效。

4、HIT-T15细胞的培养问题：

问：请教HIT-T15细胞的培养方法，可以加入GETAMICINE等抗生素避免感染吗？请上传一些图片。在显微镜下会看到黑色的点，是不是被污染了呢？

答：在配制HIT-T15细胞培养基时，加入青霉素和链霉素两种抗生素就可以避免感染。显微镜下不应该看到黑点，典型的图片可以在ATCC的网上可以查看。

5、问：病毒的冻存和解冻的具体方法？

答：具体不知道，给一点资料希望对你有帮助吧！一些化学物质如甘油、蔗糖、谷氨酸钠等，能够减轻病毒在保存过程中其它理化因子对病毒的损伤，达到保持病毒的感染性、抗原性等生物活性：

(1)甘油——它是一种广泛使用的病毒保护剂，一般采用50%甘油盐水中，大多数细菌内杀灭但病毒却存活几十天、几个月、几年。

(2)二甲基亚砜——可以减少冷冻过程中微小冰晶的形成，因此对冻存的病毒有保护作用。

(3)病毒冻干保护剂——常用的有明胶、血清、胨、白蛋白、谷氨酸钠、葡萄糖、蔗糖等。它们对病毒的保护作用是多方面。如5-10%的糖类等低分子物质是通过使干燥样品的最终水分不致过低，防止蛋白质变性；而高分子物质则能促进病毒制品在冻干过程中的升华干燥，当冻干的病毒加水复原时，还能提高溶解性。

6、诱导培养基的问题：

问：最近养前脂肪细胞，需要诱导成脂肪细胞，关于诱导剂，有些问题想请教！

(1)诱导剂需要胰岛素和氢化可地松，去sigma的网站查了查，发现仅牛胰岛素就有6种，其中有两种写明用于细胞培养，应该用哪种药品？

(2)关于诱导剂胰岛素的配置说明中让用PH<2的冰醋酸配置，园子中很多做过的朋友说用乙醇配置，是都可以么？会对后续实验有什么影响吗？

(3)诱导剂都是单独配置好浓储，保存在-20度里，用的时候现加到培养基中的吧(像单独加谷氨酰胺一样)？还是直接和培养基配置成诱导培养基，然后保存在４度里？

答：(1)I6634。(2)我们实验室用的是0.01M HCl配制的。(3)前者：个人认为每次用量比较少，没有必要配成储液，另外四度中诱导剂也比较容易被氧化(Mix)。

7、问：有没有人用5-氮-2脱氧胞苷干预细胞？哪个药是怎么配的？配好的溶液要怎么消毒？

答：此药叫地西他宾，我用于白血病细胞侏上，配完了用滤器过滤。

8、实验设计的问题。

问：流式细胞仪细胞自噬与细胞周期双参数分析：

(1)收获HeLa细胞5*105个；

(2)用4℃预冷的PBS洗2遍；

(3)然后用4%不含甲醇的甲醛冰上固定细胞15min；

(4)以PBS洗2次；

(5)80%冰乙醇固定，置-20℃冰箱过夜。固定细胞。

(6)用PBS洗两次；

(7)加入0.25%Triton-X100冰上放置5min；

(8)PBS洗2次；

(9)然后加入1%BSA处理30min，1200r/min离心5min，用1%的PBS100μl重悬细胞；

(10) 加入1%BSA稀释的兔抗人MAP1-LC3-Ⅱ(1:100)，4℃孵育过夜；

(11)再次日细胞用PBS洗3次后，加入FITC标记的羊抗兔IgG(1%BSA以1:100的比例稀释)，室温下避光孵育30min；

(12)PBS再次洗涤细胞后，用10μg/ml PI和0.1%RNase A室温下细胞核DNA染色30min，流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析。

以上是我准备做流式的步骤请教各位高手对我的实验设计有什么看法？

请问：

(1)用Triton-X100对细胞破膜后对后面的用PI检测细胞周期有没有影响？

(2)由于想节省时间和经费我想在同一个样本(同一个流式管)中同时检测LC3蛋白和细胞周期不知道可不可行？

(3)我看到文献中FCM检测细胞凋亡率的方法(约1*106个各组细胞经质量浓度70%冷乙醇固定24h，PBS清洗，加1%RNase 37℃消30min。随后，用50μg/ml碘化丙啶(PI)(sigma 公司)4℃避光染色30min；流式细胞仪488nm激发波长测定细胞DNA含量。各组均测定10000个细胞，以DNA含量低于G1期的亚二倍体细胞(sub2G1细胞)为凋亡细胞。由流式细胞仪附带软件计算凋亡百分率。)

我看与我上面的方法差不多，我能不能同时检测一下细胞凋亡率？也就是说我的同一个细胞样本同时检测一个蛋白，一个细胞周期，一个细胞凋亡率这三个指标，不知道可不可行？

答：你的protocol，洗的次数太多，固定后的细胞比较脆弱，很容易弄破，用流式的方法检测细胞凋亡率，本身是有难度的，亚二倍体的峰与碎片峰很难区别。

9、问：如何检测呼吸爆发？有没有简便易行的办法？检测过氧化氢酶一般用什么方法？

答：流式细胞术，DHR123染色。

10、流式细胞检测中怎样避免消化的单细胞再度聚集的问题：

问：(1)我在试着做了一次流式细胞检测，先消化细胞(PBS+EDTA+EGTA)，然后立刻进行细胞计数，完毕后，发现消化的细胞又聚集在了一起(形成白色絮状物)，不知哪位也发现了类似的现象，应该怎样避免细胞再聚集？细胞的再度聚集是否和细胞长时间处于消化液中有关？

答：用枪多吹打几次，我做的时候也总是这样，怀疑是细胞太多了。

(2)在细胞计数后聚集、吹打，细胞数是不是不准确了？

答：不要消化太过，我是在50%细胞浮起后就轻轻拍打，燃后立刻终止消化，酶液加edta，建议新配，这样每次波动不大，心中有数。

11、如何去除死细胞的干扰问题：

问：我打算用流式细胞仪测成年大鼠心肌细胞内钙，fluo-3 负载。由于我的成年大鼠心肌细胞是用酶灌注急性分离而来，大家都知道急性分离成年大鼠心肌细胞非常非常脆弱，正常存活率也就在70%左右，再进过处理因素折腾相信死得更多，在这情况下我用流式细胞仪测10000个细胞，岂不是其中包括相当量的死细胞，请问各位是怎么避免死细胞的干扰的？

答：你可以在上流式之前用PI或7-AAD染色，它们可以透过死细胞的细胞膜将细胞染色，而活细胞膜完整，不会染色。这样在流式细胞仪上就可以通过染色去除染色阳性的死细胞，只要阴性的那部分。这样计数活细胞就应该会比较准确。当然7-AAD会优于PI，因为PI的细胞毒性会更大，而且在流式上的图形也不会像7-AAD漂亮。可以试试。