PriCells: 正常人表皮黑色素细胞的培养

PriCells: 正常人表皮黑色素细胞的培养

实验材料：

1. 临床活检获取的正常人皮肤材料或新生儿阴茎包皮；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 黑素细胞培养液和培养基中各种添加剂的配制：包括以下种类：①胰岛素。贮存液为5mg/ml，即将0.5g的胰岛素溶于1ml 0.01mol/L的HCl液中，双蒸水加至100ml，过滤除菌、分装，-70℃下保存6个月后方可使用。使用时，在500ml培养基中加0.5ml胰岛素贮存液，即终浓度为5μg/ml；②表皮生长因子。贮存液浓度为5μg/ml，其配制方法是，取0.1mg的表皮生长因子溶于20ml的无Ca2+和Mg2+的D-Hanks液中，以0.2μm孔径的滤膜过滤除菌，按1ml分装，-70℃下保存备用。使用时，在500ml培养液中加0.5ml表皮生长因子贮存液，即终浓度为5ng/ml；③十四焕酰法佛醋酸酯（TPA）。贮存液浓度为0.25mg/ml，配制时将10mg TPA溶于40ml的100%的酒精中，分装后用Parafilm密封，于-20℃保存备用。使用时，在500ml培养基中加20μl的TPA贮存液，即终浓度为10ng/ml；④黑素细胞培养液：MCDB153培养基，使用时添加2mmol/L CaCl2，以4:1比例（V/V）添加Leibovtz L-15、2%胎牛血清、5μg/ml胰岛素、5ng/ml表皮生长因子和10ng/mlTPA，并加入40μg/ml的牛垂体提取物。4℃下保存备用。

4. 其它培养用液：①皮肤材料保存液。主要用于不能即刻进行细胞分离的皮肤材料的保存。为无Ca2+和Mg2+的D-Hanks液，使用时添加100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素、100μg/ml庆大霉素和0.25μg/ml两性霉素B，过滤除菌后备用；②表皮消化液。为0.25%的胰蛋白酶溶液。用2.5%的胰蛋白酶溶液0.5ml加4.5ml的无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液；③细胞分散液。主要用于细胞分离消化过程中防止细胞聚集形成团块。用MCDB153培养基配制含1.25U/ml中性蛋白酶、0.1%（V/V）透明质酸酶和10%胎牛血清即成细胞分散液，另添加2mmol/L CaCl2。使用时按4:1（V/V）的比例与Leibovtz L-15混合；④胰蛋白酶-Versene液。为5×的贮存液，即将2.5%胰蛋白酶溶液0.5ml加入100ml Versene液中。使用时，用无Ca2+和Mg2+的D-Hanks液将5×的贮存液稀释到终浓度胰蛋白酶为0.05%，Versene为0.02%；⑤细胞冷冻保存液。95%胎牛血清加入5%二甲基亚枫。

用于黑色素细胞培养牛垂体提取物的制备：

1．称取牛垂体腺组织25—30g（可于-70℃低温保存）；

2．解冻并用无菌双蒸水漂洗垂体组织；

3．以每克组织加2.38ml冷的0.15mol/L NaCl溶液的比例，在振荡器上振荡分散腺垂体组织，使其成为组织碎片，时间不超过30min，并维持其低温状态。然后将混合液移入2L的溶剂瓶中；

4．在2L溶剂瓶中搅动垂体组织90min；

5. 以12000r/min离心45min；

6. 将上清液收集在透析袋中，用1×PBS液于4℃下进行透析。每天更换透析液1次，共透析3d；

7. 用0.45μm的低蛋白结合滤膜过滤去除微小细胞碎片，再用0.2μm微孔滤膜过滤除菌。分装成每5ml一个包装单位，于-70℃保存。保存至6个月后才使用。一旦解冻立即加入培养基中使用；

8. 可测定提取物中蛋白质含量，并滴定培养基中最佳提取物用量（大约为40μg/ml）；

实验方法：

1. 先将皮肤材料用70%的乙醇浸泡30min，再用D-Hanks液冲洗去掉乙醇。然后切开皮肤，用组织剪剪去脂肪和皮下组织，并用外科手术刀片将处理过的皮肤材料切成2mm×3mm大小的皮片；

2. 将切好的皮肤组织皮片移入离心管中，加入表皮消化液，盖紧，摇匀。于4℃冰箱中孵育18—24h；

3. 弃去表皮分离液，加入D-Hanks液冲洗；

4. 分离表皮（透明层）与真皮（较厚而不透明）。用镊子夹住皮肤的真皮部分，将表皮面黏贴向干燥的培养皿底，轻柔地沿其表面将真皮组织与表皮剥离；

5. 将细胞分散液滴在分离后的表皮皮片上以免使表皮干燥。用细胞分散液将表皮皮片收集到离心管中，于37℃下，旋转摇动孵育2—4h（时间长短取决于细胞的分散程度，而摇动可促使游离细胞不断地从皮片中分离出来）；

6. 室温下，用D-Hanks液离心洗涤分散细胞悬液3次（每次2000r/min，5min）。洗涤时弃去可能含有胶质层的上清液；

7. 细胞沉淀后，用黑素细胞生长培养基重新悬浮细胞，并进行细胞计数。按2×105个/cm2的细胞密度种植，于37℃、5%CO2条件下培养48—72h；

8. 细胞种植48h后，换液去除未贴壁细胞。以后每周更新培养液2次。如果较多成纤维细胞的生长，可用含200μg/ml遗传霉素的黑素细胞培养液处理2—3d，以抑制成纤维细胞的生长；

9. 2周内可获得融合70%的原代培养细胞。将细胞培养物用胰蛋白酶-Versene液在室温下消化1min.，用含10%胎牛血清Leibovtz L-15培养液终止消化并收集细胞悬液。200r/min下离心3min。用黑素细胞培养液重新悬浮细胞，计数。以104个/cm2细胞密度种植传代细胞。每周更新培养液2次；

10. PriCells-原代表皮细胞特制基础培养基；

11. PriCells-原代表皮细胞培养特制添加剂；

12. PriCells-原代细胞分离试剂盒；

13. PriCells-原代细胞鉴定试剂盒；