肝功能不全实验-急性中毒性肝损伤法

急性中毒性肝损伤法是通过给小鼠腹腔注射 CCl4，造成急性肝功能不全，观察小鼠肝中毒后的行为改变及血清转氨酶的变化。

原理

急性中毒性肝损伤法的基本原理是基于四氯化碳（CCl4）对生物体有较强毒性，肝毒性尤为显著。给动物腹腔注射或灌胃后，能被迅速吸收，四氯化碳进入体内后，在肝细胞内质网中经细胞色素 P450 依赖性混合功能氧化酶的代谢，生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基。这些自由基可与细胞器膜和细胞膜的大分子共价结合，使膜结构的脂质溶解，从而影响线粒体等的结构和功能，使酶蛋白质合成减少，造成酶的破坏，因而影响代谢功能和能量的生成，致使肝细胞变性、坏死。同时胞浆内转氨酶渗入血液，血清转氨酶明显升高。

用途

急性中毒性肝损伤法可掌握小鼠股动脉取血方法和血清转氨酶测定方法。

材料与仪器

器材：

分光光度计，恒温水浴锅，离心机，微量加样器，注射器。

试剂：

①四氯化碳溶液（用花生油配制）；

②生理盐水；

③丙酮酸钠标准液；

④谷丙转氨酶基质液；

⑤磷酸盐缓冲液（pH 值为 7.4）；

⑥2,4-二硝基苯肼，0.4 mol／L NaOH。

步骤

急性中毒性肝损伤法的基本过程可分为如下几步：A. 取体重相近小鼠，分为对照组和实验组，观察一般状态、角膜反射、呼吸频率及幅度等。B. 实验组小鼠腹腔注射 0.8％CCl4 溶液 0.1 mL／10 g，对照组小鼠注射等量生理盐水。小鼠禁食、不禁水过夜。C. 造模 24 h 后，仔细观察各鼠的一般表现。利用股动脉取血法采取血液并离心得到血清。动物处死后，取出肝脏并观察。D. 血清 ALT 活性测定：首先，按下表加样，混匀，以空白管调零。520nm 波长比色，读取各管吸光度算出回归直线，或以吸光度为纵坐标，以相当于每 100 mL 血清的 ALT 单位数为横坐标绘制校正曲线。

试剂	空白	1	2	3	4	5
丙酮酸钠校正液（2μmol／mL）／mL	--	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25
相当于 100 mL 血清 ALT 单位数	-	100	200	300	400	500
谷丙基质液／mL	0.5	0.45	0.40	0.35	0.30	0.25
磷酸盐缓冲液／mL	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
		混匀，37℃ 水浴 30 min
2,4-二硝基苯肼／mL	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
		混匀，37℃ 水浴 20 min
0.4 mol/L NaOH/mL	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0

然后，取试管 4 支，分别标明实验动物空白、测定管和对照动物空白、测定管。按下表加样。

试剂	实验动物		对照动物
	空白管	测定管	空白管	测定管
血清／mL	0.1	0.1	0.1	0.1
ALT 基质液（50℃ 预温 5 min）／mL	-	-	-	0.5
		摇匀，37℃ 水浴 30 min
2,4-二硝基苯肼／mL	0.5	0.5	0.5	0.5
ALT 基质液（已预温）／mL	0.5	-	0.5	-
		摇匀，37℃ 水浴 30 min
0.4 mol/L NaOH/mL	5.0	5.0	5.0	5.0

加样完毕，摇匀，室温放置 5 min，用 520nm 波长比色，用空白管调零记录吸光度，代入回归直线或查找校正曲线求得 ALT 单位数。

注意事项

（1）采血及制备血清过程中，避免溶血。

（2）CCL 用量一定要准确。