制取原代CEF的心得

纯化病毒第一步

剪碎法CEF的制备

实验前准备

PH7.2 PBS（SW配）﹑平皿一小包（３个）﹑饭盒１（器械，玻璃漏斗）﹑饭盒2（纱布）﹑离心管２﹑碘酊﹑废液缸﹑０.１％新洁尔灭溶液﹑０.２５％胰酶﹑９日龄ＳＰＦ胚２﹑Ｍ１９９培养基

实验步骤

Ⅰ 首先SPF胚新洁尔灭溶液表面消毒，再碘酊﹑酒精消毒，最后小心敲破气室

Ⅱ 准备两把眼科弯头镊子，一把撕破尿囊膜和羊膜，另一把夹鸡胚。用镊子把鸡胚取出，浸泡于已倒入PBS的平皿中　①去爪②去内脏

Ⅲ 把鸡胚从平皿中取出，置于另一含PBS的平皿中，再一次洗涤

Ⅳ 重复Ⅳ步骤

Ⅴ 把鸡胚移至５０ml小烧杯内，小剪子剪成肉泥

Ⅵ 把肉泥吸入离心管中，如出现肉块较大，可继续剪，直至全部肉泥吸入离心管中。在离心管中加入PBS,洗３次。上清由红至清

Ⅶ 加入８ml０.２５％胰酶消化，肉泥由块状→絮状（胰酶pH7，于37℃水浴中预热）

Ⅷ 加入Ｍ199培养基终止，注意在加入培养基后轻轻混匀，切勿吹打

Ⅸ 静置沉淀后，尽量多地弃去上清，加入Ｍ199培养基，吹打，使cell掉落

Ⅹ 拿一cell培养瓶，在过滤前先用M199润湿纱布，吹打静置沉淀后吸上清，把上清加入装有４层纱布的漏斗中过滤。

Ⅺ 继续加Ｍ199培养基吹打，静置沉淀吸上清过滤，直至加入的Ｍ１９９培养基吹打后不混浊为止。

Ⅻ 细胞台盼蓝染色计数，细胞分瓶，每瓶装７００万细胞，此方法每胚约能分两瓶。

剪碎法CEF的制备缺点是获得的细胞量较少，优点是细胞活力高。

连续消化法优点是获得的细胞量大，缺点是细胞活力小。

在CEF制取好后，是病毒的侵染和固定细胞的维持最后是染色。