心气虚小鼠心肌细胞模型-心肌细胞缺氧再给氧损伤法建立心气虚小鼠心肌细胞模型

心肌细胞缺氧再给氧损伤法建立心气虚小鼠心肌细胞模型，以缺氧作为心气虚证的模拟病因，从而导致心肌的缺血，心功能损害。避免了一般整体模型受神经、体液等因素的影响， 可人为控制、干预各种影响因素，弥补体内实验之不足。

原理

心肌细胞缺氧再给氧损伤法建立心气虚小鼠心肌细胞模型的基本原理是以缺氧作为心气虚证的模拟病因，从而导致心肌的缺血，心功能损害。

用途

心肌细胞缺氧再给氧损伤法建立心气虚小鼠心肌细胞模型可结合心气虚证整体动物模型，直接反映体内的病理状态，体现中医特色。

材料与仪器

实验动物：NIH小鼠乳鼠。

试剂：Hanks液。

步骤

心肌细胞缺氧再给氧损伤法建立心气虚小鼠心肌细胞模型的造模方法如下：

A、用75% 乙醇消毒皮肤，用虹膜剪剪开胸腔，用组织镊夹取乳鼠心脏，置于Hanks液中洗涤后，剪去心房，再用Hanks液反复冲洗，洗净残留积血。

B、将乳鼠心室置于离心管的侧壁上，每个心室用虹膜剪剪碎，加人0.1% 胰蛋白酶10 ml，37 ℃水浴中振动消化10分钟，自然沉淀后弃去上清液，再加入胰蛋白酶10 ml，又置于37 ℃水浴中振动消化10分钟。吸管吹打组织1分钟后，让其自然沉淀。

C、将上清液移至另无菌离心管中 ，加入2 ml培养基终止消化。沉淀物继续按前法加胰蛋白酶进行消化，并按前法收集上清液，如此重复6次。

D、上清液用离心机5000 r/min连续离心5分钟，弃去上清液后，再加培养基重复离心1次。将细胞悬液置于培养瓶中于37 ℃恒温培养箱中静置1.5小时后，吸出心肌细胞悬液，用白细胞计数器计数后接种于美国Costar公司24孔培养板上。

E、每孔接种心肌细胞2.5×105个，每孔加含20% 小牛血清的1640培养基各1 ml，培养板四周用透明胶密封后置于37 ℃恒温培养箱中培养，2天后换培养基1次。

F、取培养3天后的心肌细胞单层进行实验，将培养板置于一容器中， 用99.99% 高纯度氮气向容器中充气1分钟后密闭容器口。

G、确保无氧环境（0 h、1 h、2 h、3 h）后，打开容器口，向内充入氧气（95% O2，5% CO2）1分钟，37 ℃静置30分钟后收集细胞上清液进行生化检查。