雄性小鼠生育力检测实验-流式细胞仪检测睾丸细胞悬液 DNA 含量

器材：

① 80 μm 尼龙筛网

② 流式细胞仪

③ 恒温水浴锅

④ 离心机等。

试剂：

① 胶原酶

② 胰蛋白酶

③ 胰酶大豆抑制剂

④ 胃蛋白酶

⑤ 碘化丙啶

⑥ RNA 酶

⑦ Tween-20

步骤

流式细胞仪检测睾丸细胞悬液 DNA 含量的基本过程如下：

1、首先制备睾丸组织单细胞悬液：移开睾丸白膜，剪碎输精小管，用含有 0.5％ 胶原酶的 PBS 在 37 ℃ 恒温水浴箱中孵育 15 分钟以释放睾丸细胞。

2、轻轻吸取剪碎的组织，PBS 洗涤细胞，800 g 离心沉降 10 分钟。用含 1.0 μg/mL 胰蛋白酶的 PBS 重新悬浮细胞。37 ℃ 再次孵育 15 分钟。

3、加入同体积的胰酶大豆抑制剂，用塑料移液管轻轻反复吸取混匀悬液 3～5 分钟，80 μm 尼龙筛网过滤。

4、滤液离心后去上清，PBS 洗涤，再次离心，取沉淀，70％ 冷乙醇固定，4 ℃ 保存进行进一步分析。

5、就 DNA 含量分析而言，1x106 细胞用 PBS 洗涤 2 次，500 μL 0.2％ 胃蛋白酶 37 ℃ 孵育 10 分钟。

6、离心后，细胞用含 25 μg/mL 碘化丙啶（propidium iodide，PI），40 μg/mL RNA 酶和 0.3％ Tween-20 的 PBS 染液常温避光染色 20 分钟。染色后的细胞用 FACScan 流式细胞仪检测。

7、实验完毕后，用 SPSS13.0 软件分析实验结果。结果示例如图 8-6-10 所示。

注意事项

流式细胞仪检测睾丸细胞悬液 DNA 含量的关键在于单细胞悬液的制备。