眼表及角膜病动物模型-角膜划痕法真菌性角膜炎动物模型

真菌性角膜炎（fungal keratitis, FK）也叫角膜真菌病（keratomycosis），它是由真菌感染引起的一种严重威胁视力的眼部化脓性疾病，常发生于植物性角膜外伤后。近年来，其发病率在我国明显升高，该病预后差，可引起角膜浑浊、溶解甚至穿孔，不仅可严重损害患者视力，还可导致眼球丧失。

原理

真菌性角膜炎建模方法很多，目前常用的有：角膜基质注射法、角膜接触镜法、针刺法、感染角膜植片法、角膜划痕法和准分子激光角膜上皮磨镶术法等。其原理均不外乎先造成模型眼角膜表层的损伤，再将培养的真菌接种于损伤部位，造成真菌性角膜炎模型。

用途

真菌性角膜炎动物模型研究显示，啮齿类为多种真菌的易感动物，与家免等相比，啮齿类与人类的基因更相近。因此，用啮齿类动物作真菌性角膜炎动物模型无论是临床症状还是真菌感染的形态学改变都等接近于人类的自然感染状况。唯一不足的是，动物眼睛较小不易临床观察。

材料与仪器

实验对象：大鼠或小鼠。实验器材：11 号手术刀片、裂隙灯显微镜。实验试剂：① 氯胺酮：甲苯噻嗪：乙酰丙嗪按 5:2.5:1 比例配制的溶液；② 丁卡因滴眼液；③ 茄病镰刀菌悬液；④ 地塞米松注射液；⑤ KOH；⑥ 吉姆萨染色液；⑦ HE 染色液；⑧ PAS 染色液。

步骤

角膜划痕法真菌性角膜炎模型的基本过程可分为如下几步：A. 根据需要选用大鼠或小鼠造模。氯胺酮：甲苯噻嗪：乙酰丙嗪按 5:2.5:1 比例配制，按照 1 ml/kg 剂量腹腔注射全麻 + 丁卡因滴眼液局麻，用 11 号手术刀片以刀背对着角膜，在角膜中央以「#」字形划痕。B. 以 100 x 106 CFU 浓度的茄病镰刀菌悬液滴眼后，闭合眼睑并轻揉 20 次，结膜囊注射地塞米松注射液 10 μl，涂妥布霉索眼膏。C. 造模后 2 天，角膜刮片真菌培养，KOH 涂片检查及吉姆萨染色观察致病菌形态，确认模型建立情况。D. 接种后第 2、4、7 和 14 天观察角膜溃疡情况并做角膜溃疡等级评分。1 级：溃疡面积 1%～25%，角膜轻度浑浊，虹膜纹理尚清，瞳孔可见，溃疡轻度不规则；2 级：溃疡面积 26%-50%，角膜较浑浊，可见虹膜及瞳孔轮廓，溃疡形态不规则，轻度水肿；3 级：溃疡面积 51%～75%，角膜不均匀浑浊，虹膜不可见，溃疡重度水肿，龛样溃疡或后弹力层膨出；4 级：溃疡面积 76%～100%，角膜均匀重度浑浊，穿孔或后弹力层膨出。E. 分别于造模后第 2、4、7 和 14 天处死模型，取 1/2 角膜行 HE 染色和 PAS 染色，光镜下观察角膜组织学变化；1/2 角膜片行真菌培养鉴定。

注意事项

接种后 2 天，可见角膜全层水肿，溃疡形成，干燥致密，粗糙不平，稍隆起；角膜刮片菌丝检出率为 100%。接种后 5～7 天，溃疡面进一步扩大，感染达最高峰，角膜缘开始出现新生血管长入。接种后 10-12 天，溃疡面积开始缩小，其周围完全被新生血管包绕。第 14 天角膜白斑形成，白斑周围无浸润，边界清，角膜周边有少量新生血管。接种后 2 天 HE 染色，角膜上皮层及基质层均有大量炎症细胞浸润，溃疡处角膜上皮及浅基质层缺损，溃疡周围角膜上皮肿胀，角膜基质纤维排列紊乱，基质内散在局灶性坏死。过碘酸-雪夫（PAS）染色可见角膜上皮层散在孢子及菌丝，且菌丝向基质层长入。接种后 4 天，HE 染色角膜基质层可见大量新生血管，前房内可见中性粒细胞。接种后 7 天，角膜基质层出现吞噬细胞。接种后 14 天，溃疡部位角膜上皮及浅基质层修复，基质内较多成纤维细胞，基质内可见较多新生血管。接种后 4～7 天，PAS 染色角膜全层可见镰刀菌，菌丝平行或斜行于角膜，呈板层生长，有分隔，圆形孢子散在生长，部分标本前房可见菌丝和孢子。