平滑肌细胞培养方法

贴壁法原代培养

1.1　细胞培养

1.1.1　培养液配制　DMEM（美国Gibco公司），Hepes（15mmol/L），青霉素（100u/ml），链霉素（100mg/ml），优质胎牛血清（原代培养浓度20%，传代培养浓度10%，美国Hyclone）。

1.1.2　培养器皿　25cm2塑料培养瓶（Costar），培养面积25cm2；直径3.5cm培养皿。

1.1.3　大鼠血管平滑肌细胞培养　动物来源：健康Wistar大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不拘，体重150~180g。动脉取材：断颈法处死Wis-tar大鼠，无菌条件下分离全段主动脉，立即置于含青霉素100u/ml，链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。每次取材2~3只大鼠。贴壁法原代培养：超净工作台上，清除结缔组织，剥除动脉外膜。纵向剖开血管，用眼科弯镊钝性刮除内膜面，以去除内皮细胞，剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗，去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞，然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起，置于无菌培养皿中。滴加少许培养液使组织保持湿润，用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底，组织块间距0.5cm。盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液，于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置培养3~5d。待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4　原代培养动脉VSMC的传代培养　当大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面，室温下大约1~2min，倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液，吸弃消化液，加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁，分散为单细胞悬液。将细胞悬液一分为二接种到新的培养瓶中，补足培养液（每瓶3~4ml）。未消失的组织块会随细胞换液、传代而除去。

1.3　培养细胞的鉴定

1.3.1　形态学　用相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规律，并依常规制作电镜标本进行观察。

1.3.2　免疫组织化学鉴定　特异性鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（福建迈新生物技术公司），采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色。（α-SM-actin免疫组织化学鉴定）

胰酶消化法培养平滑肌细胞

1.1　试剂和动物

胰酶购自Sigma公司；α-actin抗体购自中山生物技术有限公司；PBS液各成分均为市售分析纯；新生小牛血清购自HyClone；DMEM为Gibco产品。雄性Wistar大鼠（2只，体重175±25 g）购自中国医学科学院实验动物中心。

1.2　胰酶消化法原代培养

Wistar大鼠处死，迅速取出胸主动脉，浸泡在含无菌PBS的表面皿中，转移到无菌超净台。在表面皿中漂洗主动脉去除残留的血迹，纵向剪开主动脉，把主动脉铺平并使内膜朝上，用镊子来回刮除内膜层，剥离血管中膜。将剥离的血管中膜用眼科剪剪碎，碎片大小在1 mm×1 mm左右。装入含0.25%胰酶的玻璃培养瓶中于37℃条件下消化。当在显微镜下观察组织块表面出现大量细胞时应立即加入血清终止消化，一般消化的时间在3.5 h。终止消化后将玻璃培养瓶置于37℃空气摇床振摇10 min，继续用吹打的方法使组织块表面的细胞尽可能脱落。待细胞从组织块脱离后，120目细胞筛过滤，转入离心管内离心，弃上清，用含20%小牛血清的DMEM培养基吹打细胞，最后接种于25 mL培养瓶，放入CO2孵箱培养，48 h后换液。

1.3　传代培养

细胞融合后，倒去旧的培养液，加入适量的0.25%胰酶，显微镜下观察，见细胞收缩后去除消化液，加入适量培养液，吹打细胞，以1∶2接种于新培养瓶中，补足培养液，放入37℃、5%CO2孵箱培养。传代细胞从第三代开始可换用含10%小牛血清的DMEM培养基培养。VSMC至少可以传16代以上，并且从第二代开始平滑肌细胞即可冻存。

1.4　动脉平滑肌细胞的鉴定

相差显微镜下，细胞未汇合之前多数呈梭形，至汇合后，部分区域细胞束状排列，呈典型的“峰和谷”状态。将传代获得的平滑肌细胞接种于盖玻片上，3~4天后至亚汇合状态，取出细胞爬片，PBS清洗后用4℃纯丙酮固定15~30 min，自然晾干。采用小鼠抗大鼠α-肌动蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定VSMC肌动蛋白。根据S-P免疫组织化学染色的常规方法，以平滑肌细胞胞浆棕黄色为阳性结果。