一 什么是细胞自噬
细胞自噬（Autophagy）是指细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器在自噬相关基因 (Autophagy associated gene，Atg)的调控下被运输到溶酶体，溶酶体对其消化降解的过程。正常的动物细胞为了维持细胞内环境的动态平衡，需要不断降解功能失常或不需要的细胞结构，通常寿命较短的蛋白质通过泛素-蛋白酶体途径进行降解，而寿命较长的蛋白质及细胞结构则通过自噬途径由溶酶体降解。
二 细胞自噬的特征
目前的自噬可分为三类，包括巨自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA），其中巨自噬是最主要，也是研究得最多的形式。细胞自噬的过程主要包括隔离膜（Phagophore）的形成、扩展、自噬体（Autophagosome）的形成、自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体（Autophagolysosome）。自噬溶酶体形成后，内含物被溶酶体中的水解酶消化。

图1.哺乳动物的三种自噬类型

三 细胞自噬的过程
细胞自噬的过程不是一个完全被动的细胞学过程，而是细胞自身在受到外界的刺激通过一系列的细胞内信号转导，触发的一系列细胞维持内环境稳定的一种主动的生物学过程。完整的自噬发生过程大体分为以下4个阶段：自噬的起始→隔离膜和自噬体的形成→自噬体与溶酶体融合→自噬体的裂解。

                                                                                                   图2. 细胞自噬的过程（Li et al. Molecular Cancer, 2020）
四 常见细胞自噬的检测方法
检测自噬水平的方法主要有三种：电镜观察、Western Blot检测和荧光蛋白标记检测。

1.电镜观察

透射电子显微镜检测自噬基于辨认自噬体结构，是观察自噬现象的最直接、最经典的方法。

图3. 透射电镜下自噬体（单箭头）和自噬溶酶体（双箭头）形态

2.Western Blot

1）自噬过程中，LC3在合成后其C端被切割变成LC3-Ⅰ，散在分布于胞浆内；当自噬体形成LC3-Ⅰ后，与磷脂酰乙\醇胺偶联形成LC3-Ⅱ，定位于自噬体内膜和外膜，并且始终稳定保留，直到与溶酶体融合。因此可利用WB检测LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化以评估自噬的强弱。

2）p62作为自噬的重要受体，主要依赖于自噬途径进行降解。因此，p62的蛋白水平也常常用来指示自噬的降解情况。

图4. WB检测LC3、p62蛋白的表达

3.荧光蛋白标记

1）GFP-LC3

无自噬时，GFP-LC3在胞浆中弥散分布；自噬形成时，GFP-LC3聚集于自噬体膜上。在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量。

自噬体内膜上的LC3在溶酶体中被降解，因此，LC3的整体降解量可以通过GFP-LC3荧光的降低进行流式细胞仪定量检测。

2）RFP-GFP-LC3 双荧光指示系统

溶酶体内的酸性环境导致GFP荧光信号淬灭，而红色荧光蛋白对酸性环境具有很好的耐受性，可以构建RFP-GFP-LC3串联体。自噬形成时，自噬体呈黄色标记（绿色和红色图像重合），自噬溶酶体呈红色标记。