复合伤动物模型-放射复合伤造血干细胞检测模型

放射复合伤造血干细胞检测模型是由于造血干细胞对放射复合伤中的辐射因素非常敏感的原因进行研究。目前常用的造血干细胞方法，主要有脾结节法和细胞培养法。

材料与仪器

器材：

①扩散盒

②万能胶

③微孔滤膜

④钴-60y 射线

⑤灭菌机

⑥消毒纱布

⑦试管

⑧小瓶

⑨平皿

试剂：

①马血清

②2xRPMI 1640 培养液

③RPMI 1640 培养液

④1.5％ 琼脂

⑤乙醚

步骤

放射复合伤造血干细胞检测模型实验基本过程可分为以下几步：

A. 扩散盒制备是用有机玻璃制成的双面扩散小环或单面扩散小盘，内径 11 mm，厚 2 mm，容量 0.2 mL，环上开一小孔，作为加液用。使用前，在环的两个侧面或盘的一个侧面用对细胞无毒性的万能胶如曙光黏合剂，后将 0.3 μm 微孔滤膜粘牢，经密闭检查合格者，置于 80 ℃ 烤箱中，干热消毒 24 小时后备用，或经钴-60y 射线照射 2.5x10＇Gy 后备用。

B. 骨髓细胞悬液制备包括先断颈处死小鼠，经灭菌后剪开一侧后肢骨附近的皮肤，分离股骨周围肌肉，从股骨大转子和髌骨处截断并取出完整股骨，以消毒纱布抹去股骨上附着的肌肉，然后剪断股骨头和股骨的胫骨端，用注射器套上 6 号针头吸取 5 mL 培养液冲出全部股骨骨髓，再经 4 号针头过滤制成单细胞悬液。取细胞悬液 20 μl 加到 0.38 mL 白细胞稀释液中，混匀后滴在血细胞计数板上，计数每毫升细胞数（细胞数／mL＝四大格细胞总数 x1／4x20x10＋）或每根股骨的细胞总数。

受体动物照射于植入扩散盒前 24 小时，将受体小鼠用钴-60γ射线全身照射 6 Gy 或 7 Gy。然后将上述制备的骨髓细胞悬液配制成每毫升含 2.5x10°个细胞，分装于数只小瓶中，留一瓶做对照，其余分别用作不同剂量的钴-60y 射线照射。

C. 培养体系配制要求按比例如马血清 20％，2xRPMI 1640 培养液 20％，细胞悬液 20％，RPMI 1640 培养液 20％，1.5％ 琼脂 20％，依次加培养液、马血清和细胞悬液，最后加入在沸水浴中融化的终浓度为 0.3％ 的 1.5％ 琼脂培养体系中。经充分混匀后，即刻用注射器抽出来，由注入孔缓慢注入扩散盒内，每盒加 0.2 mL，内含骨髓细胞 1x10 个。每一骨髓细胞照射剂量组所配制的培养体系宜分装 3～4 个扩散盒，待全部扩散盒分装完毕，再用石蜡将注入孔封闭，放于盛有培养液的平皿中备用。

D. 埋盒培养包括将受体小鼠经乙醚麻醉后，在腹部正中作约 1 cm 长的切口，将滤膜面朝向腹腔面的扩散盒植入腹腔内。每只小鼠腹腔可植入 1～2 个扩散盒。然后缝合切口，切勿使腹腔内容物外溢。