小鼠树突状细胞培养攻略

一、方法 根据1999年lutz的方法，做了一些改进，培养DC很多人用的是高浓度的细胞，高浓度的因子，但是这样产量不高，我每一次分离一只小鼠的骨髓，大约可以得到107个细胞，分成10盘，每盘10 ml培养基，用低浓度的细胞因子，这样可以大大提高产量，每次能培养得到1*107个DC左右，流式细胞术检测：细胞纯度应该大于90%，这个方法还是很好用的。 二、具体步骤 1. C57Bl/6小鼠

2. 处死小鼠，75%酒精浸泡10 min。

3. 解剖取出小鼠股骨和胫骨。

4. 取出骨上组织。

5. 冲洗骨髓腔，直至骨变白。

6. 收集的细胞沉淀一10 000/ml接种，培养液含200 U/ml rmGM-CSF和IL-4。

7. 隔天换液并补充细胞因子，到第三天的时候如图：可以见到出芽状的突起，突起还不是特别多，也不是很长。

8. 第8天的时候，细胞形态已经出来，如图所示：

细胞形态具有典型的树突状细胞形态，长长的突起，到这个时候细胞已经比较成熟了，补充一下：第七天半量换液的时候，加入TNF-a刺激细胞成熟三、相关应用 1、瞬转树突状细胞 用包装好的病毒，直接感染DC这样做的，是腺病毒载体，方法如下：

（1）将培养成功的DC以5×106/孔接种到6孔Costar细胞培养板中；

（2）每孔加入MOI为200的（Ad-目的基因），37℃、5% CO2饱合湿度下以最小体积的培养液转染4小时。对照组采用相同MOI的Ad-LacZ腺病毒；

（3）添加新鲜培养液，继续培养48小时后收获DC；

（4）免疫组织化学检测hTERT的表达。 基因修饰DC疫苗中目的蛋白的表达鉴定，采用免疫组化方法，主要操作方法如下： (1) 将感染染Ad-hTERT的DC滴加到多聚赖氨酸包被的玻片上，室温静置20 min后，用PBS洗2次； (2) 4%多聚甲醛室温下固定10 min，用PBS冲洗3次； (3) 0.5％ Triton-X 100室温作用15 min，用PBS冲洗3次； (4) 3%H2O2-甲醛室温作用10 min，用PBS冲洗3次； (5) 10%正常山羊血清封闭，湿盒室温孵育30 min； Devil. 加1:50兔抗人hTERT一抗工作液，4℃孵育过夜后，用PBS冲洗3次； (7) 加入生物素化羊抗兔二抗工作液，37℃湿盒温育20 min，用PBS冲洗3次； Musical Note 加入辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液，37℃湿盒温育20 min，用PBS冲洗3次； (9) DAB显色3-5 min，终止反应； (10) 梯度酒精脱水后烘干，二甲苯透明，中性树胶封片。 以感染Ad-LacZ的DC及未感染病毒DC为对照，观察hTERT在正常DC中的表达，PBS代替一抗为阴性对照。

还进一步采用WB方法检测了DC中目的基因的表达。

四、常见问答 1. The bones seemed broken instead of sperated from the joint. Does it easierto get contaminated or not？ 答：分离的时候注意严格无菌操作，骨头取出来，去除了骨上组织之后，在75%无水酒精里面浸泡2分钟，然后用1640清洗4次，再冲洗骨髓，不容易被污染。 2. How many cell will you get genreally from one mouse？ 答：培养之前细胞数大约是10的7次方左右(杂的细胞），培养之后1*10的7次方，文献报道的是10的8次方，我做得最好的时候也没有那么多，保守一点。 3. 有个小疑问，DC都比较脆弱，在换液时离心收集细胞是否会造成损伤？半量换液是否可以？ 答：1 000 rpm 8 min 的离心是不会对细胞造成任何伤害的，至少我做的时候没有见到细胞因为离心死去。 4. 细胞怎么收集？成熟DC贴壁牢吗？ 答：DC前体细胞是贴壁生长的，但是在成熟过程中，细胞是悬浮生长的，不会贴壁，收集的时候收集细胞培养液离心收集。 5. DC 细胞一般用来做什么样的实验，能转染吗？ 答：DC是专职抗原递呈细胞，能在体内外激活淋巴细胞，可以用于表位鉴定等等，能用于转染，我们就做了转染的。（瞬时转染） 6. 200 U/mlrmGM-CSF和IL-4 —— 是指两种因子分别是 200 U/ml ？ 答：是的，两种因子的终浓度都是200 U/ml。 7. 第七天半量换液的时候，加入TNF-a刺激细胞成熟 —— TNF 浓度是多少，为什么加 TNF ？ 答：TNF-α一方面抑制粒细胞的产生,另一方面促进DC的成熟,使其具有很强的刺激T淋巴细胞的活性。因为我做的是要DC体外激活淋巴细胞所以加了TNF，TNF-a我加的终浓度是1 000 U/ml，刺激18小时候就收集细胞