小鼠胚胎干细胞分化潜能检测-体外分化-拟胚体方法检测ES多能性方法

体外分化的方法多种多样，但是针对 ES 多能性鉴定，一般采用拟胚体（embryoid body，EB）的方法对其三胚层分化能力进行评价。

材料与仪器

器材：

① 显微镜

② 培养箱

③ 培养板

试剂：

① 杜氏磷酸缓冲液（PBS）

② ES 细胞

③ retinoic acid（RA）

步骤

体外分化-拟胚体方法检测 ES 多能性方法的基本过程为：

1. 将 ES 细胞消化离散成约 10/ml 悬液，接种于无滋养层，无 LIF 生长因子的培养板上，用成纤维培养基培养；为加速分化过程，培养基中可适量添加 retinoic acid（RA）等分化诱导物质，或悬滴培养使细胞黏附成团。

2. 培养 3～4 天后形成 EB，最外层分化成较大细胞组成的内胚层样结构，中间为未分化的干细胞。

3. 培养 8～10 天后，EB 增大，内部出现囊腔，形成囊状胚体。

4. 在囊腔和早期分化出的内胚层之间的细胞发育成类外胚层，为上皮样细胞，该结构可持续存在 3 周左右。

5. 得到的拟胚体进一步切片，染色确定其内三胚层细胞的分布。