猪体外受精技术

体外受精（in vitro fertilization，IVF）是指在体内或者体外成熟的卵母细胞与获能精子，在体外环境中完成受精的技术过程。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物（test-tubeanimal）。这项技术不仅对于配子发育、成熟、受精和早期胚胎细胞分化的研究有理论意义，对于解决人类不孕不育等社会问题也具有重要意义，在生产方面对加速动物的繁衍也具有广泛的实践价值。

材料与仪器

器材：

① 36 ℃ 恒温水浴

② 2 个 500 ml 烧杯

③ 1 个搅棒、2 条毛巾

④ 3 个输精瓶

⑤ 1.5 ml 离心管、17 ℃ 冰箱

试剂：

① 材料：猪卵巢

② 稀释粉（Androhep．Minitube）

③ DPBS（0.1％ BSA）

④ 成熟液

⑤ 低渗液

步骤

猪体外受精技术的基本过程可分为如下几步：

（一）新鲜精液稀释

新鲜精液可在 37 ℃ 恒温下保持活率至少 1 小时，因此，去猪场前准备盛有 38 ℃ 水的保温瓶，拿到精液瓶尽快放入保温瓶，要保证在尽量短的时间内对精液进行稀释和保存。

实验室内预先准备事项：

1. 制备稀释液 将 200 ml 除菌去离子水加入 500 ml 烧杯中，同空烧杯放入水浴中。

2. 待水温上升后，称取 9.3 g（注意：不同稀释粉对应数值略有不同）稀释粉加入上述 200 ml 水中，搅棒混匀，至少平衡 40 分钟。

3. 准备 2 管 1.5 ml 离心管，分别加入 38 ℃ 预热的 990 μl DPBS。用于分别加入 10 μl 新鲜精液和稀释后精液检测密度和活率。另准备 2 管 1.5 ml 离心管，加入预热的 990 μl 低渗液以通过弯尾率检测新鲜及稀释后精液的质膜完整性。

4. 感受室内温度，空调调温至正常室温，避免室内过冷或过热。

待精液送到实验室，迅速将精液瓶取出并温和地顺时针方向滚动混匀（为了避免精子尾巴受损，切勿上下颠倒，震荡及双向滚动），吸取 10 μl 后加入事先准备好的 990 μl DPBS 中检测密度和活率，再吸取 10 μl 用于检测弯尾率。将剩余部分精液（80～100 ml）缓慢地顺着瓶壁倾倒到预热的 500 ml 空烧杯中（整个稀释过程此烧杯始终在水浴中）。将另一烧杯中的稀释液沿壁缓慢倒入精液中，同时搅棒在液体中轻轻地，缓慢地顺时针搅动，直至倒完 200 ml 稀释液。

略微混匀后，将稀释液均等地倒入输精瓶中。排尽气体后将输精瓶盖紧，包在两层毛巾中，放于室温处 20～30 分钟，再将输精瓶同毛巾放入 17 ℃ 冰箱保存（可长达 7 天）。

1 小时后，取出一管输精瓶，转动混匀，取 1 ml 稀释精液于 1.5 ml 离心管中，放进 38 ℃ 温箱 20 分钟，混匀，取 2 个 10 μl 稀释精液分别加入 DPBS 和低渗液（配方见表 4-8-5）中，用于检测密度，活率及弯尾率。

精液保存过程中要保证每 12 小时对精液进行一次混匀，以确保精子不会因为过度挤压而大量死亡。

（二）精子质量相关检测

实验室内目前常规的精子检测指标有：精子密度，精子活率，精子质膜的完整性。

1. 精子密度 取适量稀释的（一般为 100 倍稀释，即 990 μl DPBS 中加入 10 μl 精液）精子 8～10 μl 点在盖玻片和血细胞计数板间隙。当每个中格（共 25 个中格）中游动的精子数 ＞ 10 时可随机选 5 个中格的精子总数进行计数，那么意味着此稀释后的精子密度为 Nx5x10/ml。如果每个中格内精子数量不足 10 时，对所有 25 个中格进行计数，获得液体内精子密度为 Nx10/ml。

2. 精子活率 同上，但是在计数过程中将死精子进行计数。

活率 ＝ 100％ x ［（总数 - 死精子数）总数］。

3. 精子质膜的完整性 只有质膜完整的精子才能在低渗下弯尾。取适量精子加到 990 μl 预热的低渗液中，38 ℃ 放置 30 分钟，混匀取 10 μl 进行计数，对总精子数及弯尾的精子数出，进行弯尾率的检测。

弯尾率 ＝ 100％ x （弯尾精子数/总数）。

（三）猪 IVF 技术流程

IVF 前一天：

1. 晚 8：00 准备受精液（总量 15 ml）15 ml mTBM 母液，加入 0.01 g 咖啡因（2 mmol/L）溶解。再加入 0.03 g BSA (A-7888)。

（1）用 mTBM 液体制备受精滴：2 个 35 mm 皿中各加入 4 个 50 山微滴，盖上液体石蜡，放入 CO2 培养箱，过夜。

（2）IVF 洗卵滴：35 mm 皿中做 3 个 500 μl mTBM 滴。盖液体石蜡，放入 CO2 培养箱，过夜。

（3）IVF 精子稀释液：11 ml 放入盖有通气滤膜盖的 15 ml 离心管中，CO2 箱中一同平衡，用于第二天稀释精子。

2. 准备 DPBS 精子清洗液 在 15 ml 管中加入 5 ml DPBS，再加入 0.005 g［0.1％（w/v）］BSA（A-8022），过滤，置入 39 ℃ 培养箱。

3. 准备猪胚胎培养液 PZM-3：

① 9.7 ml PZM-3 基础液 ＋ 200 μl BEM ＋ 100 μl MEM ＋ 0.03 g BSA，溶解，过滤（4 ℃，1 周保质期）。

② 培养滴：5～6 个 24 孔板孔，每孔 500 μl。

③ 洗滴：35 mm 皿中做 3 个 500 μl。CO2 培养箱，过夜。

IVF 当天：

卵母细胞培养 42 小时后，按之前方法消化获得成熟卵母细胞。用 IVF 洗卵滴洗过成熟卵后将卵加入 IVF 受精滴中（30～35 卵/滴），将皿放入 CO2 培养箱。

1. 准备精子 将装有稀释精液的输精瓶取出，轻缓地转动混匀，取 1 ml 精液到 1.5 ml 离心管中。将离心管放入 38 ℃ 温箱中放置 20 分钟。混匀取 10 μl 加到 990 μl PBS 中对活精子进行计数。1.5 ml 离心管 3000 r/min 离心 5 分钟，弃上清，加入预热的 DPBS 清洗两次。最后从预先平衡的 11 ml mTBM IVF 精子稀释液取 1 ml 重悬精子。通过之前进行的计数计算最后稀释倍数，以达到最佳受精密度（精卵比为 250:1）。

2. 受精 取最终稀释好的精液 50 μl 加到每一个 IVF 50 μl 受精滴中；在培养箱中放 5 小时受精；将卵转入 PZM-3 洗滴，洗过后 30～35 卵/孔加入 PZM-3 培养孔中。

3. 发育观察 48 小时后观察并计算卵裂率，144 小时（6 天观察）获得囊胚率。