家兔体外受精技术

体外受精（in vitm fertilization，IVF）是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。

由于它与胚胎移植技术（embryo transfer，ET）密不可分，又简称为IVF-ET。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称为试管动物（test-tubing animal）。

我国家兔体外受精研究始于20世纪80年代，家兔体外受精的常规流程主要包括：超数排卵、卵母细胞的获取、精子的采集和体外受精等几个步骤。

材料与仪器

器材：

①带18～22号针头的注射器

②玻璃探针

③采精杯

④5％ CO2,38.2 ℃培养箱

⑤5 ml离心管

⑥离心机

试剂：

①材料：家兔

②促卵泡激素（FSH）

③冲卵液：

DPBS（15240-013，Invitrogen）＋0.1％ PVA（P-8136，Sigma）

④人绒毛膜促性腺激素（hCG）

⑤盐酸普鲁卡因

⑥DM-肝素液

⑦HIS液

⑧TCM-199＋兔血清培养小液滴

步骤

家兔体外受精的基本过程可分为如下几步：

一、家兔超数排卵

1. 挑选未自然发情的家兔，每天两次（上、下午）连续3天肌内注射0.3 mg，0.4 mg，0.5 mg促卵泡激素（FSH）。

2. 注射最后一次FSH后12小时，肌内注射200 U的人绒毛膜促性腺激素（hCG），然后超排母兔与公兔合笼交配。

二、卵母细胞的获取

1. 以盐酸普鲁卡因进行局部麻醉。

2. 从输卵管部位采集胚胎或者卵时，沿腹部白线向后进行3-5 cm切口，打开腹腔，取出输卵管，用玻璃探针找出喇叭口，插入内径为1-2.5 mm的冲卵管，穿线缚住。

然后从子宫管连接处朝输卵管方向插入带18～22号针头的注射器，注入3～5 ml的冲卵液进行冲洗，收集于6 cm培养皿中。

3. 而从子宫部位取胚胎或者卵时，切口位置较输卵管稍后，大概3 cm，打开腹腔，取出子宫角于前1／4处用一小血管夹夹住，用兽用16-18号注射针头在血管夹前无大血管处将宫壁穿一孔。

然后由宫管连接部朝子宫腔插入针头，注入5～10 ml冲卵液，使其由小孔处流出，收集于6 cm培养皿中。

三、精子的采集与活力检查

1.选一只处于发情期的母兔作为台兔，先将台兔放在公兔笼内，让公兔爬跨台兔进行交配，待公兔爬跨后，将其推下，注意需反复操作几次，以达到提高公兔性欲。

2.实验者同时抓住台兔的耳朵及颈部皮肤和握住采精器并使其伸到台兔的腹下，使假阴道开口紧贴台兔外阴部的下面，需注意让假阴道开口端稍低，采精杯端稍高，其倾斜角度与公兔阴茎挺出的角度一致。

3.当公兔的阴茎反复抽动时，实验者应当及时调整假阴道的高度和角度，使公兔的阴茎顺利进入假阴道内。

4.公兔射精后应立即将假阴道的开口端抬高，使精液流入采精杯内防止外流，迅速从台兔腹下抽出，将采精器竖直，取下采精杯，并将粘在外阴道口处的精液引入采精杯，加盖并贴上标签，送到人工授精室内进行精液品质检查。

四、体外受精

1. 挑选活力在0.8以上的精液，经双层灭菌纱布过滤后，取1 ml精液置于5 ml离心管中，

2. 慢慢加入4 ml的DM-肝素液，然后以1500 r／min离心5分钟，弃去上清液。

3. 加入5 ml的HIS液悬浮精子，用橡皮塞封口后置于38 ℃水浴中孵育15分钟，再以1500 r／min离心5分钟，弃去上清液。

4. 用5 ml的DM-肝素液使精子再次悬浮，并以1000 r／min离心5分钟，吸取4 ml上清液。

5. 剩下1 ml DM精子悬浮液在38 ℃水浴中轻轻摇晃3分钟后封口，以45度倾斜放在38.2 ℃，5％ CO2培养箱中培养4小时。

6. 在3 cm的培养皿中，用微量移液器制成50 μlTCM-199＋兔血清培养小液滴3-5滴，将正常卵母细胞放入小液滴里，每滴内放入约20个卵子，然后加入7.5 μl体外获能精液，

7. 用灭菌液体石蜡覆盖液滴，再用锡箔纸包裹培养皿，培养皿置于5％ CO2,38.2 ℃培养箱中，培养6小时后再重复一次受精。

8. 待受精培养12小时后检出卵子，用TCM-199液清洗2次，移入新制作的TCM-199＋兔血清培养小滴中，灭菌液体石蜡覆盖液滴，再用锡箔纸包裹后置于5％ CO238.2 ℃培养箱中培养。