耳的形态学检测实验-锇酸染色法

锇酸染色也是常用的分析毛细胞和螺旋神经节形态数量的染色方法。

材料与仪器

器材：水平摇床、加热切片机、玻璃刀片、通风橱

试剂：

① Epon-Araldite mix（每毫升的 Epon 混合液加入 20 g 顺丁烯二酸二丁酯（DBMA）混匀，真空放置 2 小时或直至泡沫消失。配方见表 8-12-1。）

② 梯度丙酮

③ PBS

④ 脱钙液（含 0.35 mol/L EDTA 的 PBS）

⑤ 道尔顿缓冲液（含 0.25％ 四氧化锇）

步骤

锇酸染色法的基本过程可分为如下几步：

A. 耳蜗样品用 PBS 清洗 3 次，水平摇床每次 10～20 分钟。

B. 每个样品小管中加入 1～3 ml 脱钙液（含 0.35 mol/L EDTA 的 PBS），放 4 ℃ 水平摇床上脱钙 3～5 天。

C. 样品放在旋转器上用 PBS 清洗 3 次，每次 10～20 分钟。同时准备 Epon-Araldite 混合液。

D. 将水平摇床放入通风橱。

E. 每个样品管中加入 1 ml 含 0.25％ 四氧化锇（OsO2）的道尔顿缓冲液，水平摇床上放置 15 分钟。

F. 将四氧化饿（OsO4）倒入有毒废液罐。

G. 水平摇床上用 PBS 清洗样品 3 次，每次 10～20 分钟。第一次清洗的 PBS 要倒入有毒废液罐。

H. 清洗样品（旋转器上，通风橱外）

50％ 的丙酮清洗 15 分钟；

80％ 的丙酮清洗 15 分钟；

95％ 的丙酮清洗 15 分钟；

100％ 丙酮清洗 15 分钟；

100％ 丙酮清洗 15 分钟；

丙酮：环氧树脂按照 2:1 混合，1 小时；

丙酮：环氧树脂按照 1:1 混合，1 小时；

丙酮：环氧树脂按照 1:2 混合，2 小时（也可室温过夜）。

I 每个样品加入 2～3 ml 环氧树脂混合液，真空中放置 1 小时或直到泡沫消失。4 ℃ 旋转器上过夜。

J. 第 2 天，将含样品的旋转器转移到室温放置 1 小时。同时配制新的 Epon-Araldite 混合液。

K. 每个样品加入新的 Epon-Araldite 混合液，旋转 2 小时。

L. 重新加入新的 Epon-Araldite 混合液，旋转 2 小时。

M. 打印标签。

N. 将样品和对应的标签以正确的位置放到模具中。

O. 65 ℃ 恒温箱放置 48～72 小时。完成后可用加热到 80 ℃ 左右的热刀片进行切片。结果见图 8-12-10。