流式细胞术检测实验-流式细胞术检测胎肝细胞凋亡

器材：

① 流式细胞仪管

② 手术器械

③ 1 mL 注射器

④ 流式细胞仪（BDFACSCalibur) 等。

试剂：

① Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒；

② 1x PBS。

步骤

流式细胞术检测胎肝细胞凋亡的基本过程可分为如下几步：

A 收集胎肝细胞，用 1 mL 注射器分离胎肝成单细胞悬液，并用细胞滤器过滤细胞悬液。

B PBS 液洗一次，1000～2000 r/min 离心 5 分钟，弃上清，收集细胞。

C 用 PBS 轻轻重悬细胞并计数。

D 取 5 万～10 万重悬的细胞，1000～2000 r/min 离心 5 分钟，弃上清。

E 加入 195 μL Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。

F 加入 5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀。

G 室温（20～25 ℃）避光孵育 10 分钟，可以使用铝箔进行避光。

H 1000～2000 r/min 离心 5 分钟，弃上清，加入 190 μL Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。

I 加入 10 μL 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。

J 随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC 为绿色荧光，PI 为红色荧光。结果示例如图 8-8-4 所示。

注意事项

1. 正式收取数据前要先用空白对照，单染的阴性对照，及双染样本做好仪器的校正工作。

2. 如需知道某细胞类群的绝对数量，请先计数胎肝总细胞数。

3. 上流式细胞仪的细胞液样本绝对不容许有组织残留，否则极易引起仪器内部管道堵塞。

4. PBS 重悬不能省略，PBS 重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续 Annexin V-FITC 的结合。

5. 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

6. 荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间并注意避光保存。