大鼠卵巢冻存保存方法

冻存（cryopreservation）是生物材料保存的主要方法之一。利用冻存技术将胚胎、配子或卵巢置于-196 ℃液氮中低温保存，可以使胚胎、配子或卵巢暂时脱离生长状态而将其生理特性保存起来，这样在需要的时候再复苏用于实验。

适度地保存一定量的胚胎、配子或卵巢，可以防止因意外事件而造成丢种，起到了胚胎、配子或卵巢的保种作用。

除此之外，还可以利用冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些特殊基因型的胚胎、配子或卵巢。

材料与仪器

器材：

①冻存管

②无菌移液枪、枪头

③超低温冰箱

④程序冻存仪

⑤维纳斯剪刀

试剂：

①材料：大鼠

②DMSO

③10％ 水合氯醛

④液氮

⑤含10％ 胎牛血清的1640基础培养液

⑥红霉素软膏

⑦盐酸肾上腺素

步骤

大鼠卵巢冻存的基本过程可分为如下几步：

1．卵巢采集 选择需要冻存保存的大鼠，颈椎处死；打开腹腔，分离生殖系统，小心暴露卵巢，撕开卵巢胞膜露出整个卵巢；用弯头的维纳斯剪刀贴着卵巢门动静脉处整个剪下卵巢；在另一侧重复同样的操作。

2．摘除卵巢去势 以体积分数10％ 水合氯醛进行腹腔注射麻醉；下腹部消毒，正中线最下胸骨与脊椎处开口，暴露卵巢与输卵管及周围的脂肪等；小心在卵巢胞膜上开一个小口，露出整个卵巢。

用弯头的维纳斯剪刀贴着卵巢门动静脉处整个剪下卵巢；滴加盐酸肾上腺素控制出血；另一侧重复同样的操作；缝合肌肉和皮肤；将大鼠放在保温台上保温，等待苏醒；伤口涂红霉素软膏抗感染。

3．冻存前处理 取出大鼠卵巢后，立即置于4℃ 含10％ 胎牛血清的1640基础培养液中；轻轻洗去血迹，用手术刀片将系膜去掉。

4．卵巢冻存 配制卵巢冻存缓冲液（如表），放入冻存管中，冰浴。将卵巢移入装有冰浴的冻存缓冲液的冻存管中，平衡30分钟；将冻存管放入程序冻存仪，从4 ℃开始，以2 ℃／min的速度降至-7 ℃。

-7 ℃渗透10分钟然后植冰；以0.3 ℃／min的速率降至-40 ℃；以10 ℃／min的速率降至-140 ℃；投入液氯中保存。

卵巢冻存缓冲液

成分 浓度 成分 浓度 成分 浓度

DMSO 1.5mol/L 胎牛血清 10% 蔗糖 0.1mol/L