DNA 酶 I 超敏感位点作图
材料与仪器真核细胞缓冲液 A EDTA 乙醇 裂解缓冲液 磷酸盐缓冲液 台盼蓝染料 DNA 酶 I 稀释缓冲液 DNA 酶 I 溶液 蛋白酶 K 溶液 RNA
材料与仪器
真核细胞
缓冲液 A EDTA 乙醇 裂解缓冲液 磷酸盐缓冲液 台盼蓝染料 DNA 酶 I 稀释缓冲液 DNA 酶 I 溶液 蛋白酶 K 溶液 RNA 酶溶液 酚：氯仿 SDS 缓冲液 TE
Sorvall H1000B 转头或等价物 带螺帽的试管 振荡水浴锅
缓冲液 A EDTA 乙醇 裂解缓冲液 磷酸盐缓冲液 台盼蓝染料 DNA 酶 I 稀释缓冲液 DNA 酶 I 溶液 蛋白酶 K 溶液 RNA 酶溶液 酚：氯仿 SDS 缓冲液 TE
Sorvall H1000B 转头或等价物 带螺帽的试管 振荡水浴锅
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的组成请参见附录 1, 贮存液要稀释到适当的浓度。
缓冲液 A
50 mml/LTris-Cl(pH7.9)
100 mmol/LNaCl
3 mmol/LMgCl2
1 mmol/LDTT
0.2 mmol/L 苯甲基磺酰氟
缓冲液 A 贮存在 4°C。临用前加入 DTT 和苯甲基磺酰氟。
EDTA（0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
裂解缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH7.9)
100 mmol/L KCl
5 mmol/L MgCl2
0.05%(V/V) 皂角苷
50%(V/V) 甘油
200 mmol/L β-琉基乙醇
裂解缓冲液贮存在 4°C。临用前加入β-巯基乙醇。
酚：氯仿
不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液
SDS 缓冲液
20 mmol/LTris-Cl（pH7.9)
100 mmol/LNaCl
70 mmol/LEDTA(pH8.0)
2%（m/V)SDS
SDS 缓冲液以室温贮存。
TE
台盼蓝染料（0.4% m/V)
适量的染料溶于不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液中，室溫贮存。
酶和缓冲液
DNA 酶 I 稀释缓冲液
10 mmol/LHEPES-KOH（pH7.9)
30 mmol/L CaCl2
30 mmol/L MgCl2
50%(V/V) 甘油
DNA 酶 I 溶液
用 DNA 酶 I 稀释缓冲液把不含 RNA 酶的 DNA 酶 I 制品稀释到浓度为 10 单位/ul。溶液贮存在-20°C。用牛胸腺 DNA 为底物，每毫升反应物每分钟 A260 值变化 0.001 所需要 DNA 酶 I 的量定义为 1 个单位。
蛋白酶 K 溶液
用 50 mmol/LTris-Cl(pH7.9) 和 100 mmol/L NaCl 溶液溶解蛋白酶 K，使浓度为 0.2 mg/ml。溶液分装后贮存于-20°C。
RNA 酶溶液
不含 DNA 酶的 RNA 酶制品溶于 TE(pH8.0)，使浓度为 0.5 mg/ml。
离心机和转头
Sorvall H1000B 转头或等价物
特殊设备
带螺帽的试管（50 ml)
预设为 50°C 和 55°C 的振荡水浴锅
附加试剂
本方案步骤 18 中需要用到列在第 6 章方案 8 和 10 中的试剂。
细胞和组织
真核细胞
每次 DNA 酶 I 超敏感位点图谱分析试验需要用大约 108 个细胞。
方法
1. 细胞旋动培养或用三角瓶、培养皿培养，然后收获约108细胞，用25 ml 冰冷的不含钙和镁离子的磷酸盐缓冲液洗两次。
另外，如乘使用新鲜的组织，则如方案1步骤 1 所述分离核酸。
2. 用 1.5 ml 冰冷的裂解缓冲液重悬细胞沉淀。冰浴10 min 使细胞裂解。
3.10ul细胞裂解液和等体积0.4% 台盼蓝染料混和，放在装有20x物镜的显微镜下观测。裂解的细胞和核酸吸收染料显蓝色，未裂解的细胞由于染料不能透过而仍然透明。继续冰浴直至>80% 细胞裂解。
4. 在 4°C 以 1300 g(用 Sorvall H1000B 转头，转速是 2500r/min) 离心 15 min, 从裂解细胞悬液中收获核酸。
5. 小心去掉上清，用1.5 ml冰冷的缓冲液 A 重悬核酸沉淀。如步骤 4 所述离心收集核酸。
6. 用 4 ml冰冷的缓冲液 A 重悬核酸沉淀。
7. 标准 DNA 酶 I 溶液作一系列稀释（用 DNA 酶稀释缓冲液稀释成 1/40，1/80，1/160，1/320，1/640，1/1280，1/2560)。稀释液存放在冰上。
8.—系列管子从 1 到 9 作标记，步骤 6 中的核酸悬液各加 180ul 到每个管中。
9. 管 1 加入 20ul 不含 DNA 酶 I 的 DNA 酶稀释缓冲液，放置在冰上直到下面的步骤 12。管 2 加入 20ul 不含 DNA 酶 I 的 DNA 酶稀释缓冲液，如下面步骤11所述放置。管 1 和管 2 作为对照。
10. 从管 3 到管 9, 依次加入 20ul 浓度递增的稀释液，即在管 3 加入 20ul 1/2560 稀释液，在管 4 加入 20ul1/1280 稀释液，等等 s
11. 管 2~9 在 37°C 放置 20 min。
12. 每管分 3 次加人 0.5 ml/L EDTA 终止反应，每次加 16.6ul, 在两次加液间振摇。所有管子处理完毕后，每管加入 12ul RNA 梅溶液。反应在 37°C 孵育 30 min使核 RNA 降解。
13. 每管加入 40ul 蛋白酶 K 溶液消化核蛋白。上下吹打混和物使溶液混和均匀。每管加入 100ul SDS 緩冲液并再次混和均匀。管子在 50°C 旋转培养 16 h。
14. 再加入 100ul 蛋白酶 K 溶液，继续在 50°C 培养 2~3 h。
15. 混合物用酚/氯仿抽提 3 次。抽提时动作要轻。加入 3 倍体积冰冷的乙醇，冰浴 30 min 在台式离心机上以 1200 g（用 Sorvall H1000B 转头，转速 2400r/min) 离心收集 DNA 沉淀。去上清，用纸巾吸干管中残存的乙醇。
16. 每管加入 200ul TE,55°C 旋摇过夜，使 DNA 溶解。
重要：为了彻底溶解 DNA 酶处理过的 DNA, 稱要长时间孵育。
17. 测定 DNA 重悬液的 A260 值，并估计其浓度。
18. 用一种限制性酶消化 DNA, 接着进行 Southern 印迹和杂交，方法如第 6 章方案 8 和 10 所述。琼脂糖凝胶的每个泳道加 15~30ug 押用限制性酶消化的基因组 DNA。
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的组成请参见附录 1, 贮存液要稀释到适当的浓度。
缓冲液 A
50 mml/LTris-Cl(pH7.9)
100 mmol/LNaCl
3 mmol/LMgCl2
1 mmol/LDTT
0.2 mmol/L 苯甲基磺酰氟
缓冲液 A 贮存在 4°C。临用前加入 DTT 和苯甲基磺酰氟。
EDTA（0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
裂解缓冲液
50 mmol/L Tris-Cl(pH7.9)
100 mmol/L KCl
5 mmol/L MgCl2
0.05%(V/V) 皂角苷
50%(V/V) 甘油
200 mmol/L β-琉基乙醇
裂解缓冲液贮存在 4°C。临用前加入β-巯基乙醇。
酚：氯仿
不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液
SDS 缓冲液
20 mmol/LTris-Cl（pH7.9)
100 mmol/LNaCl
70 mmol/LEDTA(pH8.0)
2%（m/V)SDS
SDS 缓冲液以室温贮存。
TE
台盼蓝染料（0.4% m/V)
适量的染料溶于不含钙盐和镁盐的磷酸盐缓冲液中，室溫贮存。
酶和缓冲液
DNA 酶 I 稀释缓冲液
10 mmol/LHEPES-KOH（pH7.9)
30 mmol/L CaCl2
30 mmol/L MgCl2
50%(V/V) 甘油
DNA 酶 I 溶液
用 DNA 酶 I 稀释缓冲液把不含 RNA 酶的 DNA 酶 I 制品稀释到浓度为 10 单位/ul。溶液贮存在-20°C。用牛胸腺 DNA 为底物，每毫升反应物每分钟 A260 值变化 0.001 所需要 DNA 酶 I 的量定义为 1 个单位。
蛋白酶 K 溶液
用 50 mmol/LTris-Cl(pH7.9) 和 100 mmol/L NaCl 溶液溶解蛋白酶 K，使浓度为 0.2 mg/ml。溶液分装后贮存于-20°C。
RNA 酶溶液
不含 DNA 酶的 RNA 酶制品溶于 TE(pH8.0)，使浓度为 0.5 mg/ml。
离心机和转头
Sorvall H1000B 转头或等价物
特殊设备
带螺帽的试管（50 ml)
预设为 50°C 和 55°C 的振荡水浴锅
附加试剂
本方案步骤 18 中需要用到列在第 6 章方案 8 和 10 中的试剂。
细胞和组织
真核细胞
每次 DNA 酶 I 超敏感位点图谱分析试验需要用大约 108 个细胞。
方法
1. 细胞旋动培养或用三角瓶、培养皿培养，然后收获约108细胞，用25 ml 冰冷的不含钙和镁离子的磷酸盐缓冲液洗两次。
另外，如乘使用新鲜的组织，则如方案1步骤 1 所述分离核酸。
2. 用 1.5 ml 冰冷的裂解缓冲液重悬细胞沉淀。冰浴10 min 使细胞裂解。
3.10ul细胞裂解液和等体积0.4% 台盼蓝染料混和，放在装有20x物镜的显微镜下观测。裂解的细胞和核酸吸收染料显蓝色，未裂解的细胞由于染料不能透过而仍然透明。继续冰浴直至>80% 细胞裂解。
4. 在 4°C 以 1300 g(用 Sorvall H1000B 转头，转速是 2500r/min) 离心 15 min, 从裂解细胞悬液中收获核酸。
5. 小心去掉上清，用1.5 ml冰冷的缓冲液 A 重悬核酸沉淀。如步骤 4 所述离心收集核酸。
6. 用 4 ml冰冷的缓冲液 A 重悬核酸沉淀。
7. 标准 DNA 酶 I 溶液作一系列稀释（用 DNA 酶稀释缓冲液稀释成 1/40，1/80，1/160，1/320，1/640，1/1280，1/2560)。稀释液存放在冰上。
8.—系列管子从 1 到 9 作标记，步骤 6 中的核酸悬液各加 180ul 到每个管中。
9. 管 1 加入 20ul 不含 DNA 酶 I 的 DNA 酶稀释缓冲液，放置在冰上直到下面的步骤 12。管 2 加入 20ul 不含 DNA 酶 I 的 DNA 酶稀释缓冲液，如下面步骤11所述放置。管 1 和管 2 作为对照。
10. 从管 3 到管 9, 依次加入 20ul 浓度递增的稀释液，即在管 3 加入 20ul 1/2560 稀释液，在管 4 加入 20ul1/1280 稀释液，等等 s
11. 管 2~9 在 37°C 放置 20 min。
12. 每管分 3 次加人 0.5 ml/L EDTA 终止反应，每次加 16.6ul, 在两次加液间振摇。所有管子处理完毕后，每管加入 12ul RNA 梅溶液。反应在 37°C 孵育 30 min使核 RNA 降解。
13. 每管加入 40ul 蛋白酶 K 溶液消化核蛋白。上下吹打混和物使溶液混和均匀。每管加入 100ul SDS 緩冲液并再次混和均匀。管子在 50°C 旋转培养 16 h。
14. 再加入 100ul 蛋白酶 K 溶液，继续在 50°C 培养 2~3 h。
15. 混合物用酚/氯仿抽提 3 次。抽提时动作要轻。加入 3 倍体积冰冷的乙醇，冰浴 30 min 在台式离心机上以 1200 g（用 Sorvall H1000B 转头，转速 2400r/min) 离心收集 DNA 沉淀。去上清，用纸巾吸干管中残存的乙醇。
16. 每管加入 200ul TE,55°C 旋摇过夜，使 DNA 溶解。
重要：为了彻底溶解 DNA 酶处理过的 DNA, 稱要长时间孵育。
17. 测定 DNA 重悬液的 A260 值，并估计其浓度。
18. 用一种限制性酶消化 DNA, 接着进行 Southern 印迹和杂交，方法如第 6 章方案 8 和 10 所述。琼脂糖凝胶的每个泳道加 15~30ug 押用限制性酶消化的基因组 DNA。
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