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DNA实验

基因克隆:高效感受态细胞制作

2024-06-13 DNA实验 加入收藏
原理主要原理是通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理,使细胞膜的通透性发生暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。因RbCl法


原理

主要原理是通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理,使细胞膜的通透性发生暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

因RbCl法制备的感受态细胞转化效率较高,本实验操作以此为例说明。

材料与仪器

细胞样品
MnCl2 HEPES CaCl2  SOB 培养基 SOC液体培养基 液氮
水浴锅 三角瓶 玻璃瓶 冷冻离心机 滤膜 离心管 称量天平

步骤

一、LB培养基配制(固体培养基加2%琼脂粉)

酵母粉Yeast Extract      5g

蛋白胨Peptone/g    10g

NaCl                     10g

                   1000ml


二、TFBI溶液配制

RbCl(氯化铷)                               5 g

1 M KAc(醋酸钾)                   12.3 ml

1 M CaCl2(氯化钙)                  4.1 ml

1 M MnCl2(氯化锰,粉色)     20.5 ml

glycerol(甘油)                         61.5g

0.1 M HAc(醋酸)                      8 ml   调节pH至5.8

超纯水                         补足至410ml

注:配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌。


三、TFBII溶液配制

1 M MOPS (pH 6.5,溶液为黄色)       1.5 ml

1 M CaCl2(氯化钙)                            11.25 ml

1 M RbCl                                              1.5 ml

glycerol(甘油)                                       22.5 g

1 M KOH(氢氧化钾)                     调节pH至6.5

超纯水                                       补足至150ml

注:配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌。


四、高效感受态细胞制备

1. 取实验室-80度保存的DH5α菌种在无抗性的LB平板上划线,37度培养过夜,进行活化。;

2. 从LB平板上挑取单菌落,尽量选择菌落较饱满,边缘平滑,个头较大、长势较好的菌落;

3. 挑选上述单菌落接种于装有10ml无抗性LB液体培养基的25ml锥形瓶中;

4. 37℃下振荡培养过夜(摇床转速200rpm,12h左右),进行充分活化;

5. 将上述菌液以1:100的比例接种到大的锥形瓶中,37℃振荡培养2~3h至OD590达0.4~0.6;

6. 将培养好的菌液转入洁净无菌的50mL离心管中,冰上放置10min(此时,可以将配置好的TBFI溶液冰浴预冷了,离心机也要开始预冷了,如果你们的离心机降温较慢,最好再提前一点);

7. 在4℃下,4000rpm离心10min,弃去上清;

8. 加入初始细菌培养基1/2.5的冰上预冷的TBFI溶液(如果前面使用的是60ml,这里则为60/2.5=24ml),轻轻悬浮细胞,冰上放置10min;

9. 4℃,4000rpm离心10min,弃去上清;

10. 加入初始细菌培养基1/25体积的预冷TBFII(如果前面使用的是60ml,这里则为60/25=2.4ml,也即为TBFI的1/10,当然具体体积也可以根据个人经验上下变动),轻轻悬浮菌沉;

11. 分装至EP管中,每管分装100ul(EP管最好预冷,分装过程要求在冰上进行);

12. -80度长期保存(至少可以保存一年).

注意事项

1. 挑选低代数的菌种是关键,千万不要每次活化后保存活化后的菌种,更不要将菌种长期保存在-20度。


2. 大肠杆菌在平板上过夜生长后,可置冰箱中保存一个月左右;接种新鲜的菌落或菌液有利于细菌细胞的同步快速生长,从而使细菌群体在达到一定的OD值后(0.375)大部分细胞都处于感受态。


3. 大肠杆菌的生长需要氧气,剧烈振荡的目的是提高培养基的溶氧量以利于细菌的生长。


4. 达到细菌对数生长早、中期,需时约2.0——2.5小时,此步骤至为关键,若超过此阶段,则转化效率急剧下降。


5. 低温操作的目的是使细胞不再生长,保持其感受态。


6. 洗涤细胞时细胞较脆弱,悬浮沉淀时动作要轻,可用移液枪轻轻吸打。


7. -80℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后,转化率很快降低。可用一已知标准及浓度的闭环质粒如pUC18/19鉴定感受态细胞的转化能力。

常见问题

为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个因素:


1. 细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过检测培养液的OD600来控制。


2. 质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。


3. 试剂的质量:所用的试剂需是最高纯度的(GR或AR),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。


4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管、移液器吸头等最好是新的,并经过高压灭菌处理,所有的试剂都要过滤除菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。


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