浅谈各类不同样本的制备方法

随着代谢组学的发展，已经有越来越多的领域开始在用代谢组学方法来进行研究，因此用于代谢组分析的样本也多种多样。本文拟从动物、植物、微生物等几个主要方面，对这些不同样本的制备方法做出相应介绍，旨在为各位研究人员的实验提供一个具体参考。

1、动物样本的制备方法

a) 血液样本制备

i. 采集血液样本，通常会在采集后于室温下放置30 min以上，等待蛋白质的凝结或是待抗凝剂与血液混合均匀；

ii. 离心取上清（若加了抗凝剂，则此时取的是血浆；若没有加抗凝剂，则此时取的是血清），常用的离心条件一般是4 ℃、5000 rpm，离心10 min，当然不同实验室在实际操作时可能会略有变动；

iii. 参考Patrizia Bernini等[1]的做法，将300 μL磷酸缓冲液（含70 mM Na2HPO4、38 mM NaN3和55 mM TMSP，用20%的D2O配制，pH = 7.4）加入300 μL的血浆/血清样本中，然后取450 μL该混合溶液转移到4.25 mm的核磁管中待测。实际上，缓冲液的配方和PH值多种多样，一般会根据具体的生物样本类型来选择。而对于有抑菌效果的NaN3，当样本是现采现测时，很 多研究者也会选择不使用添加。

b) 尿液样本制备[2]

i. 收集尿液样本，放在-80 ℃保存；

ii. 在做NMR分析前将尿液样本取出解冻并在6000 rpm下离心15 min取上清；

iii. 在540 μL上清液中加入60 μL含0.1% TSP和2 mM NaN3的缓冲溶液（pH = 7.4，1.5 M KH2PO4的D2O），这一步可以有效稳定尿液样本的PH值，在混匀后待测。尽管此文献中没有特别注明，但通常建议离心过程应在4 ℃下进行，以防止离心过程中产生的热量很可能会导致微生物的产生，从而改变代谢物的组成。

c) 脊髓液样本制备[3]

i. 收集脊髓液，首先离心去除细胞组分，然后于-80 ℃下保存；

ii. 在NMR分析前，将脊髓液拿出来解冻，使用离心超滤膜 去除3000分子量以上的脂质和蛋白质分子；

iii. 超滤收集约585 μL体积的滤液，然后加入65 μL标准溶液 ，再加入少量NaOH或HCL调整样本的PH值在6.8±0.1；

iv. 取600 μL该混合液到5 mm核磁管中待测。

d) 组织样本制备

在文献[4]中，作者对肌肉组织做了基于NMR检测的提取条件的一些比较，发现提取溶剂以甲醇/氯仿/水（v/v/v, 2/2/1.8）为最佳，与组织的比例为30 mL/g。另外作者还用了三种不同方法来破碎样本，分别是研磨并冻干的样本粉末、研磨过的湿组织样本和电子组织匀浆器（5 mL/g的提取溶剂比例）处理过的湿组织样本，发现冻干粉样本的谱图基线明显比另两种方法处理的要更平一些，而且样本间的差异最小，匀浆法次之。冻干粉样 本的制备方法为：

i. 离体组织在液氮条件下速冻，并且于-80 ℃下保存；

ii. 液氮条件下研磨；

iii. 冷冻干燥得到冻干粉；

iv. 以30 mL/g的比例加入提取溶剂甲醇/氯仿/水（v/v/v, 2/2/1.8）。

v. 将样品涡旋3次，每次15 s，中间停顿的时间应将样本放在碎冰上使之维持低温态。

vi. 在4 ℃、10000 g的条件下离心10 min，去除上清液，即得代谢物的提取溶液。

由于处理得到冻干粉样本一般都要耗费较长时间，为了兼顾较高的提取效率、良好的重现性以及操作的简便和快速，因此可以考虑使用匀浆法来制备组织样本，并使用甲醇/氯仿/水（v/v/v, 2/2/1.8）作为提取溶剂。

2、植物样本的制备方法[5]

一般而言，植物的代谢状况会因其生长周期、选取部位和刺激条件等不同而呈现出明细差异，因此在采集植物样本时，实验者应尽量减少因样本的采集差异而 引进的变量。其次，由于液氮的低温可以防止样本中降解反应的发生，因此大多使用液氮速冻样本并研磨成粉末。

另外，水分的存在可能会使植物样本的代谢物发生 酶促反应，又或者可能会改变样本的PH值，从而对分析结果造成较大影响，因此通常都会对粉末样本进行冷冻干燥。

NMR代谢组分析所需的样本量一般在50 mg到500 mg之间，具体所需的量不仅取决于样本本身的类型，而且还跟所选的提取溶剂有关。但一种溶剂是不可能将样本中的所有代谢物一次性都提取出来的，因此对提取 溶剂的正确选择对代谢物的提取至关重要。

代谢物有极性和非极性之分，溶剂亦然。根据相似相溶原理，使用高氯酸可以很好的提取到极性代谢物，但对酸敏感的代 谢物则不适用；在提取极性为中等偏上的代谢物时，最为广泛的选择是使用甲醇/水（v/v, 1/1）的混合溶剂；另外还有研究人员在实验时会选择使用两相溶剂，如水/氯仿、甲醇/水/氯仿等，这类溶剂可以更有效的去除诸如脂质类的成份，但后续处 理时需要进行溶剂分离，因此操作上相对繁琐。

当然，在提取的过程中，为了稳定样本的PH值，通常还会选择加入磷酸缓冲溶液（比如含0.1% TSP的D2O，pH = 6.0）。详细的制备过程可归纳如下：

i. 收集样本；

ii. 液氮速冻研磨；

iii. 冷冻干燥得冻干粉；

iv. 称样（50-500 mg/个）；

v. 加提取溶剂；

vi. 涡旋30 s - 2 min，使样本与提取溶剂混合均匀；

vii. 在室温或冰浴条件下进行超声萃取20 min，充分提取样本中的代谢物；

viii. 离心取上清（若上清液浑浊，则需要进行多次离心操作）；

ix. 取800 μL上清液准备进行NMR检测。

3、微生物样本的制备方法

微生物种类繁多，至少有十万种以上，但总体来说可以分为三大类，一类是真核细胞型微生物（比如真菌），一类是原核细胞型微生物（比如细菌），还有一类是非细胞型微生物（比如病毒）。本文从中选取了2个实例作为微生物样本制备方法的参考：

a) 酵母菌样本[6]（属真菌类）

i. 向样本中加入-40 ℃预冻的60%甲醇溶液（含10 mM CH3COONH4，PH = 7.5），在缓冲液保护状态下达到灭活微生物的目的，以防止有生命的微生物在做提取时可能会改变代谢物的组成；

ii. 在干冰乙醇浴(-50 ℃)中静置2 min，以保证灭活完全；

iii. 4000 rpm，-9 ℃下离心5 min；

iv. 去除上清液，并用1 mL含有10 mMCH3COONH4(PH = 7.5)的75%乙醇溶液作为提取溶剂；

v. 加入内标溶液；

vi. 80 ℃水浴3 min，其中每30 s涡旋一次；

vii. 4000 rpm，-9 ℃下离心10 min；

viii. 取上清液准备进行NMR检测。

b) 多糖降解菌群Saccharophagusdegradans[7]（属细菌类）

i. 使用0.45 μm、直径为30 mm的尼龙滤膜，真空过滤1 mL的该细菌培养液；

ii. 使用2.3%的NaCl溶液冲洗样本，以除去残留的培养液和胞外代谢物等成分，同时为了防止细胞反渗透或是细胞膜发生破碎导致胞内代谢物外流，因此要避免用清水冲洗样本；

iii. 在0 ℃下使用1 mL提取液对载有细胞的滤膜进行提取（15 min）；

iv. 分离提取液后，再次加入1 mL提取液重复步骤iii；

v. 将iii和iv得到的提取液合并，然后在16100 rcf下离心5 min；

vi. 取上清液离心蒸发去除溶剂；

vii. 使用500 μL 50% ACN再次提取，以去除脂类及蜡；

viii. 再次离心蒸发去除溶剂。

4、其他样本的制备方法

a) 海洋生物样本的制备--蚌类（R. philippinarum）[8]

i. 完成实验后马上解剖得到内收肌并使用液氮快速冷冻，保存于-80 ℃冰箱；

ii. 将内收肌（100 mg）匀浆并使用4 mL/g甲醇，5.25 mL/g水和2 mL/g氯仿进行提取；

iii. 甲醇/水相被收集到玻璃瓶里并用离心蒸发仪去除溶剂；

iv. 使用600 μL 100 mM的磷酸缓冲溶液复溶（使用D2O制备并含有0.5 mM TSP，pH = 7.0）；

v. 涡旋，并在3000 g，4 ℃下离心5 min；

vi. 取550 μL样本移入5 mm核磁管内待测。

b) 葡萄酒[9]

酒类样本的制备非常简单，无需其他复杂前处理，只需对酒样进行冷冻干燥处理，以去除样本中过多的乙醇信号即可，但这种方法同时也会除掉样本里的一些其它易挥发物，比如CH3COOH等。甚至有研究人员是直接选择使用特殊脉冲序列压制乙醇和水的信号的。

前面本文介绍了一些常见样本大类的制备方法，内容大多借鉴的各类已发表文献（文献列表已附）。下面会给大家介绍一些安隆科讯在多年的实验室操作中所积累的实用经验：

1、不要在血液样本中使用抗凝剂

在处理血液样本时不要向血液中添加抗凝剂，因为抗凝剂的添加会使血液中的纤维蛋白无法凝结沉淀，因此所得的血浆样本就比血清含有更多的蛋白质，而这些蛋白质的NMR信号会掩盖许多其他有用的代谢物信息，不利于后面的数据分析；

2、使用Millipore超滤膜去除大分子

对于蛋白质、脂质等含量较多的样本，比如血清、脊髓液和组织提取液等，我们强烈建议使用Millipore超滤膜 过 滤去除3 KDa以上的大分子，然后使用更为简单的1D NOESY序列直接进行数据采集即可。

为了更直观的看到谱图质量的提升效果，我们设计了一个小实验来做这样一个比较：上方橙色谱图是采用 CPMG序列（压制大分子的信号峰）采集的一个未使用超滤膜过滤的血液样本图谱，而下方蓝色谱图则是采用1D NOESY序列采集的一个使用了超滤膜过滤的血液样本图谱。

从图上可以非常清楚的看到，在化学位移0.5-1.5 ppm处，橙色图谱上大分子信号非常明显，而且掩盖了周围其他小分子信号的信息，但在去除这些大分子以后，在蓝色图谱上可以非常清楚的看到这些对于我们非常重要的小分子信号。

3、选择DSS作内标

TSP价格便宜，使用方便，因此是研究人员最常使用的内标之一。但是TSP容易产生跟大分子结合的问题，会导致TSP本身的峰被拓宽变形，而使用DSS则可以非常好的避免这样一些问题。

4、使用ACDSS商用标准液

安隆科讯的核磁代谢组分析技术能够做到对代谢物的绝对定性定量分析，所以对内标浓度的准确性有着严格要求。前面我们已经阐述过建议使用DSS作内标的原因，但由于DSS的吸水性会给准确称量带来困难，从而影响代谢物的绝对定量，因此我们建议研究人员使用ACDSS商用标准液 。

该标准液的浓度已通过NIST认证标样的校准，并准确测定过PH值，使用时直接向被测样本添加即可（建议70 μL ACDSS + 630 μL样本）。

本文对不同样本的制备方法给出了一个较为详细的介绍，同时也向大家分享了安隆科讯自己积累的一些经验，以供代谢组学研究人员作参考。由于时间仓促， 文中有些地方可能做得不够详尽和完美，希望大家见谅，也欢迎大家多多给予意见和建议，可发送至support@anachro.com，谢谢！

参考文献：

[1] Patrizia Bernini, IvanoBertini, Claudio Luchinat, etc.Standard operating procedures for pre-analytical handling of blood and urine for metabolomic studies and biobanks. J Biomol NMR, 2011(49): 231-243.

[2] Nicola Culeddu, MatildeChessa, Maria C. Porcu, etc.NMR-based metabolomic study of type 1 diabetes. Metabolomics, published online: 25 March 2012.

[3] Aifric O'Sullivan, Rodney E Willoughby, Darya Mishchuk, etc. Metabolomics of cerebrospinal fluid from humans treated for rabies. J. Proteome Res., published online: 19 Nov 2012.

[4] Ching Yu Lin, Huifeng Wu, Ronald S. Tjeerdem, etc. Evaluation of metabolite extraction strategies from tissue samples using NMR metabolomics. Metabolomics, 2007(3): 55-67.

[5] HyeKyong Kim, Young Hae Choi and Robert Verpoorte.NMR-based metabolomic analysis of plants. Nature Protocols, 2010(5): 536-549.

[6] Jennifer Christina Ewald, Stephanie Heux, and Nicola Zamboni. High-Throughput Quantitative Metabolomics: Workflow for Cultivation, Quenching, and Analysis of Yeast in a Multiple Format. Anal. Chem., 2009( 81): 3623-3629.

[7] Min Hye Shin, Do Yup Lee, Kwang-Hyeon Liu, etc. Evaluation of Sampling and Extraction Methodologies for the Global Metabolic Profiling of Saccharophagusdegradans.Anal. Chem. 2010(82): 6660-6666.

[8] Huifeng Wu, Xiaoli Liu, Jianmin Zhao, etc. NMR-Based Metabolomic Investigations on the Differential Responses in Adductor Muscles from Two Pedigrees of Manila Clam Ruditapesphilippinarum to Cadmium and Zinc. Mar. Drugs, 2011(9): 1566-1579.

[9] Young-Shick Hong. NMR-based metabolomics in wine science.(wileyonlinelibrary.com) DOI 10.1002/mrc.2832.