EB(Ethidium bromide,溴化乙锭)
溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号,可用Polaroid 底片或带CCD 成像头的凝胶成像处理系统拍摄。
观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中,大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。
当染料分子插入后,其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致与DNA结合的染料呈现荧光,其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。
这两种情况下,被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍,所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭(0.5ug/ml)时,可以检测到少至10ng的DNA条带。
溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸(DNA或RNA)。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小,所以其荧光产率也相对较低。事实上,大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。
尽管在该染料存在的情况下,线状DNA的电泳迁移率约降低15%,因此,当需要知道DNA片段的准确大小(如DNA限制酶酶切图谱的鉴定),凝胶应该在无EB情况下电泳,电泳结束后用EB染色。染色完毕后,通常不需要脱色。但是在检测小量DNA(小于10ng)片段时,通常要将染色后的凝胶进行脱色。
一、溴化乙锭的损害
溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性!
SYBR Green I 和溴化乙啶(EB)Ames 测试结果显示EB容易引起有机体突变。(Singer et al., Mutat. Res. 199, 439: 37- 47.)
溴化乙锭溶液的净化处理
由于溴化乙锭具有一定的毒性,实验结束后,应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置,以避免污染环境和危害人体健康。
(1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液,可如下处理:
①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml;
②加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4,混匀,再加入等量的2.5mol/L HCl,混匀,置室温数小时;
③加入一倍体积的2.5mol/L NaOH,混匀并废弃。
(2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理:
① 按1mg/ml的量加入活性炭,不时轻摇混匀,室温放置1小时;
② 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。
CTAB缓冲液(DNA提取液)
十六烷基三甲基溴化铵 别称:西曲溴铵、溴棕三甲基铵、溴烷铵,鲸熔三甲基溴化铵;CTAB;CTMAB;HTAB;CTABr;阳性皂
英文名 Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide;Cetrimonium Bromide
分类 季铵盐
代码 A-15 CAS号 57-09-0 EINECS 登录号 200-311-3
分子式 C16H33(CH3)3NBr
分子量 364.446
熔点:250-237℃ 水溶性 13 g/L (20°C) 纯度(含量) >99%
二、物理化学性质
本品呈白色或浅黄色结晶体至粉末状,有刺激气味,易溶于异丙醇,可溶于水,震荡时产生大量泡沫,能与阳离子、非离子、两性表面活性剂有良好的配伍性。具有优良的渗透、柔化、乳化、抗静电、生物降解性及杀菌等性能。本品化学稳定性好,耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。
用途 本品为天然、合成橡胶、硅油和沥青乳化剂;合成纤维、天然纤维和玻璃纤维的抗静电剂、柔软剂;护发素的调理剂;相转移催化剂;乳液起泡剂、表面活性剂,分析试剂,涤纶真丝化剂,皮革加脂剂,它还用于助焊剂、焊锡膏生产里起表面活性剂作用,活性强,对亮点、虚焊、焊电饱满都有一定作用。
HLB值15.8,熔于热水、乙醇、三氯甲烷,易熔于异丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于醚。有良好的表面活性、稳定性、杀菌性及生物降解性。在强酸及强碱中穏定,耐热、耐光。与非离子及两性离子表面活性剂有良好的配伍性,对多种油脂具较好的乳化作用.对皮肤及粘膜刺激性小,有轻微脱脂作用。
是一种阳离子去污剂,广泛用于润湿、杀菌、抗静电、去污、增溶等方面。可用作纤维高效抗静电剂。工业及油田水处理中用作杀菌灭藻剂、粘泥剥离剂。牙膏中用作口腔杀菌剂。用于香波及护发素,可使头发易于梳理、光滑、柔软。
还右用作矿物浮选剂、电镀液缓蚀剂、沥青乳化剂、硬表面清洗剂及有机合成相转移催化剂等。还具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在这种条件下,蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里,在高离子强度的溶液里,CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。
因此,CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括E.coli的某些株)中制备纯化DNA 。
三、重要用途
提取DNA配方
CTAB为十六烷基三甲基溴化铵,
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;
Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。
CTAB 4g
NaCl 16.364 g
1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)
0.5M EDTA 8ml,先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌
冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇(400ul)氯仿-异戊醇(24:1):先加96ml氯仿,再加4ml异戊醇,摇匀即可。
提取RNA配方
2% CTAB(W/V)
2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V)
100 mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置)
25mM EDTA
0.5g/L 亚精胺Spermidine
2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入)
由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。
(责任编辑:大汉昆仑王)