用定量酶联免疫分析法（ELISA）检测鼠的抗双联DNA抗体的血清浓度水平

一、试剂与材料 1.  鲑鱼精DNA（Invitrogen）   2.  45 μm 孔径滤器（USAScientific）   3.  96孔板（BD Biosciences）   4.10×PBS-Tween20（0.1 M PBS，0.5%Tween20，pH7.4）： （1）Na2HPO4（无水），10.9g   （2）NaH2PO4（无水），3.2g   （3）NaCl，90g   （4）蒸馏水，1000ml   （5）充分混匀溶解，调pH值至7.4，并加入5 ml Tween20，室温保存。使用前用蒸馏水稀释10倍，如果有需要再调pH值。   5.  封闭液：在PBS中加入5%胎牛血清（FBS，Hyclone）或者3%牛血清白蛋白（BSA）。   6.  合适种类的鼠免疫球蛋白（Sigma）   7.  辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体（SouthernBiotech）   8.  ABTS过氧化物酶底物溶液A和B（KPL）。   9.  ABTS过氧化物酶终止液（KPL）。   二、操作步骤：   1.  用45 μm 滤器过滤双链鲑鱼精。   2.  在96孔板的每个孔内加入100 ul 浓度为100 ug/mL 的鲑鱼精DNA。   3.  用塑料膜包裹96孔板，4℃过夜。   4.  甩掉溶液并用1×PBS-Tween洗六次。   5.  干燥96孔板，并在每孔中加入100 ul 封闭液。   6.  室温1.5小时。   7.  甩掉封闭液并用1XPBS-Tween洗5次。   8.  用含有1%BSA的PBS稀释鼠血清。   9.  每孔加入100 ul 稀释过的鼠血清，重复2到3个。血清最好是用含有1%BSA的PBS稀释，这样能保证滴定所需的最佳的灵敏度。   10.  在孔中加入一系列梯度稀释的高滴定度的血清样品。   11.  37℃温浴1小时。.   12.  甩掉血清并用1×PBS-Tween洗10次。   13.  每孔加入100 ul 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠的二抗，二抗用含有1%BSA的PBS稀释4 000倍，37℃温浴1小时。   14.  甩掉血清并洗10次。   15.  每孔加入100 ul 1：1混合的ABTS过氧化物酶底物A和B。   16.  室温黑暗处理，温浴时间根据实验的不同而不同。   17.  每孔加入100 ul ABTS过氧化物酶终止液终止反应。   18.  在410 nm 波长下，用ELISA读数仪读取96孔板的数据。   19.  利用由高滴定度血清样品做不同比例稀释得到的标准曲线计算血清样品的浓度。