酶标记法检测细胞凋亡

  [材料与试剂]              (1)平衡缓冲液；        (2)反应缓冲液；        (3)TdT酶；        (4)反应终止/洗涤液；        (5)过氧化物酶标记的抗地高辛抗体；        (6)蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS；       (7)30％H2 O2 ；        (8)DAB显色液：0.05％的diaminobenzidine (DAB)溶于PBS，用前过滤并加入0.02％H2 O2 ；        (9)甲基绿染液：0.5％甲基绿溶于0.1mol/L枸橼酸钠，pH调整到4.0；        (10)塑料盖玻片及玻璃盖玻片。        [样品来源]              同荧光标记法。        [操作步骤]       (1)固定：同荧光标记法；        (2)内源性过氧化物酶封闭：玻片置于盛有0.5％H2 O2 缓冲液的染色缸内，室温下作用20min  后，同荧光标记法洗涤；        (3)消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室温下消化15min，同上洗涤；        (4)平衡处理：将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干，滴加平衡缓冲液(按70μl/cm2 )覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5～10min；        (5)反应：移去盖玻片，倾去平衡液，用吸水纸吸干周围液体，滴加反应液(按50μl/cm2，18μl TdT酶+36μl反应缓冲液)，均匀覆盖在细胞或组织上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃温育1h；        (6)终止反应：移去盖玻片，将玻片置于盛有终止/洗涤液的染色缸内，37℃下洗涤30min(置摇床上振摇)。然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗2次，每次5min。        (7)地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加70μl过氧化物酶标记的地高辛抗体，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置湿盒中孵育30min；       (8)洗涤：置于洗涤缓冲液内，洗2次，每次5min；       (9)用吸水纸吸干细胞或组织四周液体，滴加新鲜配制的DAB显色液，均匀覆盖，加盖塑料盖玻片，室温下作用3～6min；        (10)洗涤：置于蒸馏水中洗三次，每次3～6min；       (11)套染：将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中，室温下染色10min；        (12)洗涤：蒸馏水洗涤三次(置摇床上)，每次2min；        (13)脱水、封片：100％正丁醇，三次，每次2min；二甲苯，三次，每次2min；明胶甘油封片；           [结果判断]        光学显微镜下观察，所有细胞核均着绿色，凋亡细胞核染色质显示出特异性的棕黄色。