MHC-I单体的生物素化

单体HLA-1类分子必须借助于其他分子的连接才能形成四聚体，一般借助生物素-亲和素将单体HLA-I类分子连接为四聚体，这种连接方式要求HLA-I分子重链C端或轻链上能够与生物素结合。此步骤是在BirA酶（生物素-蛋白连接酶）的作用下，将生物素结合到HLA-I类分子重链的BSP位点上。         [试剂及材料]       1. 100mM  生物素（Tris-base中）       2. 100mM  ATP(PH7.0)       3. 100mM  PMSF(异丙醇中)       4. 1mg/ml  Leupeptin(白胃素) （水中）       5. 1mM   Pepstatin （胃酶抑素）（甲醇中）         [操作步骤]         1. 将下述物质加入上一步的收集液中。       ①生物素，终浓度为400uM       ②ATP，终浓度为5mM       ③PMSF，终浓度为200mM       ④Leupeptin，终浓度为1ug/ml       ⑤Pepstatin，终浓度为1uM       ⑥15ul  BirA酶, 终浓度为0.1uM         2. 室温下孵育过夜。         3. 将上述生物素化反应液置低温离心机中，用最大速度离心以去除沉淀。