PCR产物的酶切

经过电泳回收的PCR产物直接酶切的效果往往不佳。这主要是因为酶切位点太靠近片段两侧,缺乏足够多的保护碱基。要克服这一问题，要么在最初引物设计时加上较多的保护碱基，要么用过量的限制内切酶长时间消化。而后者的效果并非特别理想。我们尝试首先将PCR产物互相平连，再以过量限制性内切酶长时间消化，得到了较好的效果。这种方案的潜在危险在于当酶切仍不完全时最后得到的片段两端很可能带有同一种酶的识别序列，从大小上无法区分。 一、直接消化的方案 VHPCR产物 1μg(大约10μl) (B.M.)10×H缓冲液 15μl (B.M.)XhoI 100U (B.M.)SpeI 50U 超纯水补至 150μl，37℃消化20h。 对VLPCR产物的消化，XbaI应用100U，EcoRI应用50U，37℃消化20h。 二、先平连再消化的方案(以重链为例)： 1. 削平反应和磷酸化反应：总体积20μl VHPCR产物 10μl(约1μg) 10×Promega连接缓冲液 15μl 2mmol/L dNTP 2μl PNK 1μl(1U) Klenow 1μl(1U) 水4μl，37℃反应1h，65℃10min失活。 2. 平连反应： 上步反应物 20μl 10×Promega连接缓冲液 3μl 40％PEG8，000 4μl PromegaT4DNA连接酶 1μl(3U/μl) 水 2μl 总体积30μl，23℃过夜连接，65℃灭活10min，用无水乙醇沉淀后溶解于适量的TE中。此时若取约100ngDNA电泳，应当见到在390bp左右DNA条带已基本消失，代之的是从二聚到多聚体DNA条带。 3. 内切酶消化： VHPCR平连产物 1μg (B.M.)10×H缓冲液 15μl XhoI100U SpeI50U， 加超纯水补足至150μl，37℃消化20h，65℃灭活10min。直接用Promega公司的PCR纯化Kit回收纯，重溶于适量TE中。 4. 载体的酶切消化 pFUW80 1μg B.M.10×H缓冲液 2μl XhoI1μl SpeI1μl 水补足至20μl，37℃消化2h，65℃灭活10min，立即用0.7％的琼脂糖凝胶电泳,用GenecleanKit回收或低熔点胶回收均可。 库的连接反应每1.5μg消化的载体与0.5μg消化的PCR产物连接,加入20U连接酶在200μl内23℃过夜连接，70℃10min灭活，无水乙醇沉淀。70％乙醇洗涤后，吹干。用15μl超纯水溶解，50℃加热1min,在振荡器上振荡10s，以充分溶解DNA。置于冰上10min，即可用于电穿孔转化。