单克隆抗体技术：克隆化

经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要 3 ～ 5 次克隆才能稳定。

克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。

有限稀释法

1 ．材料

（ 1 ）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔 2 万～ 4 万。

（ 2 ） HT 培养基

2 ．操作方法

（ 1 ）取出抗体阳性孔细胞，用 HT 培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。

（ 2 ）用 HT 培养液将细胞稀释成 200 个 /ml 、 40 个 /ml 、 20 个 /ml 和的悬液。

（ 3 ）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔 0.05ml ，细胞含量分别为 10 个 / 孔、 2 个 / 孔、 1 个 / 孔和 0.5 个 / 孔。

（ 4 ） 5 ％ CO2 饱和湿度， 37 ℃ 培养。

（ 5 ）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

（ 6 ）克隆大量繁殖后，布满孔底的 1/3 ～ 1/2 时，测培养液抗体。

（ 7 ）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传 2 ～ 4 代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。

软琼脂克隆化

借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：

1 ．配 2.5 ％的琼脂糖 30ml ，水浴溶化后，移入 45 ℃ 水浴中。

2 ．将 117ml 完全 DMEM 液和 3ml 10 倍浓度的 DMEM 液混合，置 45 ℃ 水浴预热。

3 ．将琼脂糖与 DMEM 液混合，即为含 0.5 ％琼脂糖的完全 DMEM 液，并加 75 × 108 脾细胞。

4 ．每块平皿加 10ml ，于室温中凝固。

5 ． DMEM 中的细胞与 DMEM —琼脂 1 : 1 混合，将细胞琼脂混合物 2ml 铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。

6 ．放入 CO2 箱饱和湿度， 37 ℃ 培养 10 天。

7 ．用 PBS 配制 0.6 ％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置 45 ℃ ，在保温情况下取一试管，迅速加入 0.1ml 25 ％羊红血球， 0.2ml 豚鼠补体， 2.7ml 0.6 ％琼脂糖。

8 ．用 3ml 琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。于 37 ℃ CO2 箱孵育 1h~2h 。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球 Ig 。

显微镜操作法

在直径 6cm 培养皿中，加入 1ml 1.0 × 108 细胞悬液放置 5 ％ CO2 饱和湿度， 37 ℃ 温箱中放置 30min 以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有 2.0 × 104 ~5.0 × 104 饲养细胞 96 孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。

荧光激活分离法

用一种荧光激活细胞分类器（ Fluorescein Activafed Cell Sorter ， FACS ）。其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。