免疫组织化学-体内原位检测信号分子表达变化

免疫组织化学 - 体内原位检测信号分子表达变化       免疫组织 化学染色是引入附有标记物的外源性抗体(或抗原)，使之锚定于组织或细胞标本中相应的抗原(或抗体)部位，标记物经呈色反应而显示代检抗原(或抗体)，因此，免疫组织化学可按标记物的种类以及定位方法分类。按标记物分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫金银法、放射免疫自显影法等；按定位方法则分为一步法(又称直接法)、二步法(包括间接法、夹心法、补体法)和多步法(包括桥连法)等。一般说来，一步法染色步骤简捷，特异性强，但敏感性较差，且标记抗体适用范围窄。二步法及多步法经抗体放大，敏感性明显提高，标记抗体可一标多用，但染色步骤多、耗时，特异性不如直接法。     在组织学研究中，利用两种物质之间的高度亲和能力及其可标记性，以显示其中一种物质的方式称亲和组织(细胞)化学。这些亲和物质如葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A，SPA)与免疫球蛋白(IgG)、生物素(biotin)与抗生物素(avidin)、植物凝集素(1ectin)与糖分子、受体与配体，荧光素、酶、同位素等都可作为标记物而与之结合。在实际应用中，亲和组织化学常与免疫组织化学相结合，即为亲和免疫组织(细胞)化学。下面介绍其中的亲和免疫组织化学ABC法。     生物素为水溶性维生素H，相对分子质量仅244，可与抗体交联，也能与酶标记物结合。抗生物素又称卵白素或亲和素，为碱性蛋白，相对分子质量67 000，含4个结构相同的亚基，可与生物素或荧光素、酶等偶联。生物素与抗生物素结合后很稳定，对pH值的变化及多种蛋白酶都有耐受力。以抗生物素为桥，使生物素偶联的抗体(AbABio )与生物素化的酶(Bio*)相联，染色时可序贯上片，也可预先使Avi与Bio*按一定比例混合，组成抗生物素-生物素-酶复合物(Avi-Bio*)。后者是较大的类似晶格的复合体，其中有较多的酶分子，从而大大提高了酶染色的灵敏度，这种方法称为ABC法。     1．材料与试剂     (1)组织切片，厚3～4btm。     (2)针对检测抗原的抗体(-     (3)生物素化二抗。     (4)ABC试剂(至少在用前半小时配置)。     (5)正常血清(根据二抗选择)，工作浓度1：20     (6)0．3％H2 O2 -甲醇溶液。     (7)DAB显色液。     (8)0．01mol／LPBS(pH7．4)。     (9)1％甲基绿。     2．染色步骤     1)石蜡切片常规脱蜡至水：二甲苯1 3～5rain(冬天可延长至5～10rain)一二甲苯Ⅱ3-5min--100％乙醇1-2min---95％乙醇11～2min一95％乙醇Ⅱl一2min一80％乙醇1min一70％乙醇1min----自来水洗片刻一蒸馏水洗片刻。     2)去除组织内源性过氧化物酶活性：切片人0．3％H2 O2 甲醇溶液，37~C，30rain。     3)切片经水洗，蒸馏水洗7-8次。     4)修复     (1)胰蛋白酶修复：0．1％胰酶消化液(100mg胰酶+100mgCaCl2 溶于100m1TBS中)预热30min，切片人预热的0．1％胰蛋白酶消化液，37C，30min。     (2)微波修复     柠檬酸缓冲液：柠檬酸(0．1mol／L)3．8mid-柠檬酸三钠(0．1mol／L) 16．2ml+180m1 ddH2 0(pH 6．0)     微波照射时所用输出功率一般在750一l 000W，微波照射后室温冷却30min。     5)切片经蒸馏水洗，再用PBS洗5minX 3次。     6)擦去组织周围PBS，滴加1：20正常血清，置切片于湿盒内，37~C，20min。     7)倾去正常血清，滴加一抗，37C，lh，移至4C冰箱过夜。     8)切片用PBS洗5minX 3次。     9)滴加生物素化二抗，37C，1h。     10)切片用PBS洗5rainX 3次。     11)滴加ABC试剂，37℃，45min。     12)切片用PBS洗5rainX 3次。     13)滴加DAB显色液，显色时间为5～10rain(显微镜下控制显色程度)     14)切片经蒸馏水洗，入0．1％甲基绿复染细胞核。     15)切片脱水、透明、封固、镜下观察。