细胞免疫化学：免疫酶标技术

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1 ） 直接法

1．标本固定。 2．PBS 洗涤2×3分钟。 3．1％ H2O2（或1％ H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。 4．正常血清（1：10）孵育，室温20分钟。 5．滴加酶标记的抗体37℃1小时或4℃过夜。 6．PBS洗涤3×3分钟。 7．DAB＋H2O2显色5～10分钟，镜下控制染色结果。DAB＋H2O2应用前15分钟配制。 8．充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

2 ） 间接法

1．标本固定。 2．PBS洗涤2×3分钟。 3．1％H2O2（或1％H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。 4．正常血清（1：10）孵育，室温20分钟。 5．滴加第一抗体，37℃1小时或4℃过夜。 6．PBS洗涤3×3分钟。 7．滴加酶标二抗，室温1小时。 8．PBS洗涤3×3分钟。 9．0.04％DAB＋0.03 ％H2O2显色5～10分钟。 10． 充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。

3 ） PAP 法（过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法）

1．标定固定后，PBS洗涤。 2．1％H2O2（或1％H2O2 甲醇）阻断内源性过氧化物，室温10～20分钟。 3．PBS洗涤2×3分钟。 4．正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20分钟。 5．滴加一抗，室温1小时或4℃过夜。 6．PBS洗涤3×3分钟。 7．滴加二抗，室温30分钟。 8．PBS洗涤3×3分钟。 9．加PAP复合物，室温60分钟。 10． PBS洗涤3×3分钟。 11． 0.04％DAB＋0.03％ H2O2显色5～10分钟。 12． 充分水洗。 13． 苏木精复染，封片观察。

4 ） 双 PAP 法

1～10同单PAP法。 11． 二次加酶标二抗。 12． PBS洗。 13． 二次加PAP。 14． PBS洗。 15． 0.04％DAB＋0.03 ％H2O2显色5～10分钟。 16． 苏木精复染核，封片，镜检。

5 ） ABC 法（卵白素－生物素－过氧化物酶复合物法）

1～8同PAP法 9）加ABC液，室温60分钟。 10） PBS洗。 11） 0.04％DAB＋0.03％ H2O2显色5～10分钟。 12） 充分水洗。 13） 苏木精复染核，封片，镜检。