免疫组化非特异性背景染色及控制手段

一、非特异性染色的识别 常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。二、非特异性染色的原因1. Ig 与 Fc 受体结合多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。避免方法：① 用以二抗相同种族的正常血清封闭切片；② 用不含Fc段的抗体，但价格贵（V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化）2．静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。避免方法：① 尽量稀释一抗② 降低抗体的电荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS；③ 用去垢剂 如triton-100处理切片。 Tween-20等；3.二抗与组织中的Ig结合如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越明显，如人与猴，兔与豚鼠。避免方法：用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。4．组织中残存醛基与Ig的结合如醛类固定后未能彻底的冲洗，残流醛基可以和Ig结合。避免方法：①彻底冲洗；② 0.02%的新鲜的硼氧化钾液处理10分钟后冲洗；5．内源性过氧化物酶红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。避免方法：① 石蜡切片 0.3%双氧水-甲醇溶液处理切片；② 冰冻切片 3%双氧水处理切片5分钟（99：1）因为未经固定包埋，大部分酶未被破坏；③ 对于骨髓涂片最好用非过氧化物酶标记的抗体如碱性磷酸酶（AP）↓磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料↓快兰(fast blue)或快红(fast red)↓ ↓兰色 红色用明胶甘油封片，不能用含二甲苯的封片剂，溶于二甲苯。6. 内源性生物素以 24mg/ml 的卵白素封片15分钟；7. 交叉反应PcAb敏感性高，但特异性稍低，容易出现非特异性染色。避免方法：①尽可能稀释 抗体 ；②尽可能用McAb;三、 抗体 最大稀释度的求法最大稀释度的目的：1.节约、2.特异性染色↑、非特异性染色↓（决定其最大稀释度）棋盘法如 稀释度1：50，1；100， 1：150， 1；200特异性染色 +++ ++ ++ +非特异性染色 ++ + - -