免疫组化技术的关键问题汇总（2）

一、组织处理

恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。

1、组织及时取材和固定 组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2 h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5 cm×2.5 cm×0.2 cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3 cm×5 cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2 cm，否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。

对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2 h内，一般固定时间不应超过24 h。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。

2、组织脱水、透明、浸蜡 组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水l h×3次，二甲苯透明l h×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65 ℃。

二、切片

组织得到很好处理后在进行切片之前还应对玻璃片进行处理，由于我们检测抗原是多种多样的，因染色操作程序复杂，时间较长，有些抗原是要进行各种抗原修复处理，如微波、高压、水溶酶等，玻片如果得不到很好的处理，将易造成脱片，为保证免疫组化实验的正常进行，要求在贴片前对载玻片作适当处理，必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处理以防脱片。

1、Poly-L-Lysine (多聚左旋赖氨酸) 一般采用分子量30000左右的0.5%多聚赖氨酸最好，也可用试剂公司出售的其浓溶液以1：10去离子水稀释。方法是将玻片浸泡其中，倾尽余液，在60 ℃温箱中烤干备用，此方法的优点是可以用于多种组织化学、免疫组化及分子学检测中的应用，粘贴效果最好，但价格稍贵。

2、明胶硫酸铬钾法 将2.5 g明胶加热溶于500 ml蒸馏水中，完全溶解冷却后加入0.25 g硫酸铬钾搅匀充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中2 min，取出控尽液体入温箱中烤干备用。此法价格便宜、方法简单，任何实验都可以使用，特别适用于大批量的使用，但应注意，如果液体变蓝或粘稠状停用。

3、APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷) 此法必须现用现配。将洗净玻片入1:50丙酮稀释的APES中，浸泡20 s，取出稍停再入丙酮或蒸馏水中刷去末结合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片应垂直烤片不能平拷，否则组织片中易出现气泡。

切片必须保持切片刀锐利，切片要薄而平整、无皱摺、无刀痕，如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象，切片厚度一般为3~4 μm，切好的切片在60 ℃温箱中过夜，注意烤片的温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破坏，而产生抗原标记定位弥漫现象。