qPCR失败，罪魁祸首原来是

终于把一批小鼠样品的荧光定量实验做完了，可以松口气了。期间吃过亏，也学到了很多经验。今天刚好有时间，就把这些经验写下了，跟大家分享交流，希望对跟我有相同经历的人有所帮助。 先说说我吃的亏吧：提取小鼠心脏RNA，做逆转录，然后用逆转录的CDNA做Real-time PCR。最后发现，Real-time PCR结果CT值都很大，连内参的CT值也超过了32。当时看到这个结果就懵了。别人的Real-time PCR结果我见过，CT值一般在30以前，内参至少是在20附近的。当时，很着急啊，怀疑是不是试剂出问题了？咨询了试剂公司的技术支持，同时也请教了一些师兄师姐。针对原因，他们也给了我一些建议。 下面就开始了我漫长的找原因之路：先从Real-time PCR各个组分找。。。。。。终于陆续排除SYBR GREEN MIX、引物的因素， 最后发现是CDNA模板的问题。然后开始找逆转录的原因。。。。。。排除了super mix的因素，只剩下了 RNA的问题。 RNA的问题，很疑惑？？？ 后来听从了试剂公司技术支持的建议，把RNA跑了下胶，胶上显示我的RNA都降解了。以前我们这RNA都不跑胶的，觉得没必要，就测下OD260的值，有值就可可以。现在我知道了，原来降解的RNA也有OD260值的。 RNA降解了，说明我的RNA没提好！为什么呢？ 关于这个问题我又是一圈的请教，查资料。最后发现是我的样品保存不当造成的。我当时十几个老鼠都杀完后，把取出来的心脏一起冻到-70℃的。RNA在杀老鼠到-70℃的这段时间就降解了。 这前前后后原因找了半个多月。浪费了很多的时间和精力，关键老板还在后面盯着要结果，日子可是不好过啊！哎，吃一堑长一智吧! 吃了亏，也学习到了经验。因此后面的一百多只老鼠的样品都做的挺顺利的！ 现在分享下我的经验吧，希望对大家有所参考： 第一，样品用正确的方法保存。首先液氮保存是可以的，提出的RNA的效果也挺不错的。但是我在吃亏长经验过程中呢，学到了一种新的方法：溶液保存法。这种方法挺好用的，简单方便，反正最后的提出来的RNA挺好的。刚开始用的是life公司的RNAlater，效果挺好的，但价格太贵了，1ml要10块钱呢。后来换了家vazyme公司的RNA keeper，大概2块钱1ml，效果也挺不错的。 第二，小心谨慎的提取RNA了。我用的是就是传统的有机溶剂提取法。因为vazyme公司的RNA keeper用的效果还不错，所以提RNA也用了他们家的试剂，叫RNA isolater，效果还可以，价格上要比Invitrogen公司的TRIZOL便宜好多。提取的过程大家还是很熟悉的，不过实验室的环境还是很重要，尽量给自己开辟一块相对安全的区域吧。 第三，评价我们提取的RNA。（这一节我是用血的教训总结出来的啊！） 评价分两步：第一步，酶标仪检测；第二步，电泳检测。 第一步：酶标仪检测可以得到以下信息： （1）得率：检测到的量＝OD260×稀释倍数×40ng/ul（2）纯度：OD260 /OD280 < 1.9 说明有蛋白污染OD260 /OD280 ＝1.9 ～2.1说明纯度很好OD260 /OD280 > 2.1说明有部分降解 第二步：电泳跑胶 琼脂糖胶浓度1%，我根据酶标仪数据每个提好的RNA上样500-1000ng，电泳15min左右，就看的挺清楚的。 这个过程我认为： （1）电泳槽要刷干净，第一次用的话用0.5M NaOH浸泡20min以除去RNase，然后用灭菌水或超纯水冲两遍，倒新配的1×TAE缓冲液。近期再跑的话，不用再用NaOH浸泡了，但电泳槽要刷干净，倒新配的1×TAE缓冲液。 （2）电泳时间不能太长，条带能分开就好了，跑的时间越长RNA降解的风险越大。 这个28S的亮度是18S的两倍，说明这个RNA的完整性很好，没有降解。因为没有RNA的mark，所以就用了DNA的，这个大小仅供参考。 最后，评价工作做好后，把好不容易得来的RNA冻存到-80℃去。等着进行下一步逆转录试验啦。 这些就是我这批实验做完后，关于RNA提取的一些心得和体会，吃过亏，也学到了经验吧。这让我想起了一个师兄说过的一句话：你们现在这些成熟的实验方法和经验，都是前辈们用血的教训换来的！我再加一句：我们小伙伴们，且做且珍惜吧！ 由于时间原因，还有一些关于逆转录和Real-time PCR的心得体会，等到后面有时间的时候再跟大家分享吧。 祝大家实验顺利!