WB蛋白免疫印迹（Western Blot）实验操作详解
蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上，然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程，如下图所示，包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。
样品制备
1、蛋白提取
1）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必须分装成0.5-1X106个细胞/管，然后再裂解。
组织样本：按照每20 mg组织加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5 min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
【注】：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。
产品详情：
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 目录价/元 |
RIPA lysis buffer (strong) RIPA裂解液（强） | 100 mL | ||
RIPA Lysis Buffer (Medium) RIPA裂解液（中） | 100 mL | ||
RIPA lysis buffer (Weak) RIPA裂解液（弱） | 100 mL | ||
Lysis Buffer for WB/IP Assays 免疫印迹及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液 | 100 mL | ||
PMSF苯甲基磺酰氟 | 1 g | ||
5×1 g |
2、蛋白定量
1）配制BSA标准品体系
标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1XPBS进行稀释。BSA标准品体系配制可参考下表。
表1 BSA标准品体系配制（微孔板检测，线性范围20-2000 μg/mL）*
Vial | 稀释液体积( μL) | 2mg/mL BSA体积( μL) | BSA终浓度( μg/mL) |
A | 0 | 100 | 2000 |
B | 25 | 75 | 1500 |
C | 50 | 50 | 1000 |
D | 125 | 75 | 750 |
E | 150 | 50 | 500 |
F | 350 | 50 | 250 |
G | 375 | 25 | 125 |
H | 395 | 5 | 25 |
I | 400 | 0 | 0=Blank |
*如用比色皿检测，每管需加100 μL标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300 μL。
2）取25 μL标准品或待测样品加入到微孔板中。
3）每孔加入200 μL BCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30 min。
4）冷却到室温，在酶标仪上的540-595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为最佳。
5）根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/mL；Y-最终的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
产品详情：
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 目录价/元 |
BCA Protein Quantification Kit BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）
| 500 T | ||
2500 T | |||
5000 T |
SDS-PAGE电泳
1）剪开包装取出预制胶，撕去胶板底端蓝色胶带，缓慢地拔出梳子，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满电泳缓冲液，外槽液体加入量要高于电泳槽高度1/3。可用移液枪或其他工具吸取电泳缓冲液轻轻吹打加样孔，去除加样孔内残留的储存缓冲液和杂质。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）按照每4 μL蛋白样品加入1 μl 5XSDS-PAGE 蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热 3-5 min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）在每个样品孔中上样10-30 μg蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，推荐150V，跑30-40 min，通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳结束，取出凝胶，使用起胶器或其他合适的工具插入到胶板两侧之间的空隙中，慢慢的上下撬动上、中、下三个不同的位置，然后在另一侧重复操作，直至胶板两侧完全打开。
7）胶板打开后，凝胶可能粘在胶板的任意一侧，将有凝胶一侧的胶板倾斜至水中，轻轻拨动凝胶，使凝胶自由掉落到装有水的器皿中，晃动清洗凝胶，然后取出进行后续转膜实验。
产品详情：
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 目录价/元 |
5×SDS-PAGE Protein Loading Buffer5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 | 2×1 mL | ||
20×1 mL | |||
500 mL | |||
Precast Protein Plus Gel, 4-20%, 10 wells, Hepes-Tris 4-20%高分辨率预制胶(Hepes-Tris)，10孔 | 1 盒（10 块） | ||
Precast Protein Plus Gel, 4-20%, 15 wells, Hepes-Tris 4-20%高分辨率预制胶(Hepes-Tris)，15孔 | 1 盒（10 块） | ||
GoldBand Plus 3-color Regular Range Protein Marker (8-180 kDa)三色预染蛋白质分子量标准（8-180 kDa） | 250 μL | ||
2×250 μL | |||
10×250 μL | |||
GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker (10-180 kDa)三色预染蛋白质分子量标准（10-180kDa） | 250 μL | ||
2×250 μL | |||
10×250 μL | |||
GoldBand 3-color High Range Protein Marker (10-245 kDa)三色预染蛋白质分子量标准（10-245 kDa） | 2×250 μL | ||
10×250 μL |
转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5 min。（如果检测小分子蛋白质，可省略该步骤，因小分子蛋白容易扩散）。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10 min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2 min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。（膜的选择：0.45 μm孔径，用于一般蛋白；0.22 μm孔径，用于分子量小于20 kD蛋白）
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液（300 mA, 60 min），或使用快速转膜液（400 mA, 15-35 min）
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5 mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10 min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。注：如果没有出现染色条带，则表示转膜失败，可能需要重新转膜或重新上样电泳。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5 min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5 min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5 min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时或使用快速封闭液（10 min）。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
产品详情：
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 目录价/元 |
0.45 μm PVDF膜（进口分装，8.5×13.2 cm） | 10张/包 | ||
10×Fast Transfer buffer 10×快速转膜液 | 500 mL | ||
Fast Blocking Western 快速封闭液 | 100 mL | ||
500 mL |
抗体孵育
1）将膜和一抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10 mL一抗稀释缓冲液中在4ºC下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5 mL TBST洗涤三次，每次15 min以去除残留的一抗。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10 mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
产品详情：
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 目录价/元 |
β-actin, Mouse mAb小鼠抗β-actin单克隆抗体 | 50 µL | ||
100 µL | |||
GAPDH (Clone1A6) Mouse mAb 小鼠抗GAPDH 单克隆抗体 | 20 µL | ||
100 µL | |||
Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L) 过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L) | 100 µL | ||
Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L） | 100 µL |
蛋白检测
1）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
2）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液（125 μL发光工作液/cm2膜）中，与发光工作液充分接触。室温孵育3 min，准备立即压片曝光。
3）用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。
4）在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。
5）暗房内压X光胶片，分别曝光不同的时间，如数秒到数分钟。显影冲洗。（从刚开始的10s曝光时间中可以看出适当的曝光时间。由于检测反应的动力学特征，在孵育后信号立即变得最强，但在随后的2小时内会减弱）
产品详情：
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 目录价/元 |
Super ECL Detection Reagent ECL化学发光超敏显色试剂盒 | 100 mL | ||
100 mL |
其余相关产品推荐
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 目录价/元 |
InStab Protease Cocktail, EDTA-free, mini, tablet-form 蛋白酶抑制剂Cocktail，EDTA-free，迷你型，片剂 | 1瓶（10片） | ||
1瓶（50片） | |||
InStab Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free, 100×DMSO Stock Solution 蛋白酶抑制剂Cocktail，EDTA-free，100×DMSO储液 | 1 mL | ||
10×1 mL | |||
100×1 mL | |||
InStab Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×, Stock Solution) 磷酸酶抑制剂混合物（100×，储存液） | 2 mL | ||
10×2 mL | |||
100×2 mL | |||
Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit 细胞核/细胞浆蛋白抽提试剂盒 | 50 T | ||
100 T | |||
Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit 细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒 | 50 T | ||
100 T | |||
PAGE Gel Quick Preparation Kit (10%) PAGE凝胶快速制备试剂盒（10%） | 125 mini gels | ||
PAGE Gel Quick Preparation Kit (12.5%) PAGE凝胶快速制备试剂盒（12.5%） | 125 mini gels | ||
Enhanced ECL Chemiluminescent Substrate Kit 增强型ECL化学发光检测试剂盒 | 100 mL | ||
500 mL |
相关文章
