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同仁CCK8操作说明与检测步骤(附初学者问答)

2021-07-28 谱图库 加入收藏
细胞活性检测 1. 在96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。将培养板放在培养箱预培养 (在37 ℃,5% CO2的条件下 )。2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡,它们会影响 O.D值的读数) 。3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。5. 如果暂时不测定O.D值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入

细胞活性检测

 

1. 96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml / ) 。将培养板放在培养箱预培养 (37 ℃,5% CO2的条件下 )

2. 向每孔加入10 ml CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡,它们会影响 O.D值的读数) 

3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。

4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5. 如果暂时不测定O.D值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。

细胞增殖 -毒性检测

 

1. 96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 37 5% CO2的条件下 )

2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 48小时 )

4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡,它们会影响 O.D值的读数

5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。

6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7. 如果暂时不测定O.D值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。

注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基,去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

制作标准曲线

 

1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。

2. 按比例 ( 例如:1/2比例 ) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做 3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。

3. 接种后培养2-4 小时使细胞贴壁,然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定 O.D值,制作出一条以细胞数量为横坐标 (XO.D值为纵坐标 (Y的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8后的培养时间)

同仁CCK8检测步骤

 CCK-8 检测步骤

 

 

1. 向各孔中加入100 μl细胞悬液。a)

2. 37℃下预孵育培养板。b)

3. 向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10 μl

4. 37℃下孵育。

5. 向各孔中加入10 μlCCK-8溶液d)

6. 37℃下孵育1-4小时。e)

7. 测定450 nm处的OD值。

 a) 使用适当的培养基制备50,000-100,000/ml的细胞悬液。

 

b) 建议使用CO2培养箱过夜预培养。

c) 使用培养基或PBS来制备溶液。

d) 如果待测溶液有还原性,测定不含细胞,但含有CCK-8的待测溶液在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小,则可以直接加入CCK-8 ,如果吸光度相对较大,则需要除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的100 μl培养基和10 μl CCK-8进行检测。

e) 白细胞可能需要培养较长时间。

 活力计算

 

细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A0加药)-A(空白)×100

A(加药):具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白):具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度

A0加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

 

*细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力


DOJINDO CCK8 
初学者问答 (同仁DOJINDO)

1.一个孔中应接种多少个细胞?

当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 / (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 / (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

2.
能否用384孔板进行试验?

可以。向各孔中加入培养基体积10%CCK-8溶液,如果加入的CCK-8体积太少,可以先将CCK-8溶液稀释1倍,然后加入培养基体积20%的量。

3.
能否用24孔板进行试验?

可以。向各孔中加入培养基体积10%CCK-8溶液。

4.
酚红会影响检测吗?

不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

5.CCK-8
与胸苷结合检测之间是否有相关性?

有。然而,请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同,因此结果可能不同。

6.CCK-8
能否检测细菌细胞?

可以检测E.coli,但不能检测酵母细胞。向100μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液,并培养1-4个小时或过夜。

7.CCK-8
稳定吗?

CCK-8
0-5下能够保存至少6个月,在-20下避光可以保存1年。如果需要长期保存,我们推荐-20的储藏条件。

8.
如果没有450nm的滤光片,还可以使用哪些其他滤光片?

还可使用450nm490nm之间的滤光片。

9.如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差?

可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

10.CCK-8
是什么颜色?

应该是粉红色。若颜色不一样,有可能会影响测定。

11.CCK8
能否对活细胞进行染色?

不能。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST8),并通过电子载体1Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的,因此CCK8不能对细胞进行染色。

12.CCK8
检测溶液对细胞是否有毒?

CCK8
溶液自身因为高浓度的1Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是,加到培养基中的CCK8是没有毒性的,因为被稀释了10倍。因此,长时间的培养,如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8检测后还可以用于其他细胞增殖检测,如结晶紫检测,中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同,因此在需要进行长时间培养时,先检测一下细胞在加入CCK8培养后的活力。

13.在做加药实验时,药物对测定是否有影响?如何解决?

有时会有影响。如果药物具有还原性,会和CCK8发生显色反应,增加吸光度。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK8,测定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基 (CCK8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK8之前更换培养基,去掉药物的影响。

14.
每次测定的数值不一样,是什么原因?如何解决?

可能会有以下几个原因: 1. 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差,建议在加入CCK8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000100,000/孔范围内摸索条件。

15.如何设定空白对照?

在不含细胞的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度作为空白对照。

16.
哪些物质会影响CCK8的测定?

当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定,例如含有维生素CGlucose (一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。

17.
在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,如何解决?

可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如:可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

18.
设定参比波长的目的是什么?必须设定吗?

不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。

19.
说明书上仅写了96孔板的测定方法,如果使用24孔板货12孔板,应该加多少量CCK-8试剂?

一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10

20.CCK-8显色过程中,如何终止反应?

有一下几种方法(96孔板): 1、在显色反应后,将培养板放置4冰箱内。 2、每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、每孔加10 μl 1%w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在24小时之内测定。

21.
必须预培养细胞吗?

不一定。如果要向保持细胞的最好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

22.如果加入的药物中含有金属,是否会有影响?

金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%15%90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话,将会100%抑制。

23.CCK-8
试剂的保存条件?

在避光条件下CCK-8试剂在4可保存一年。如果需要保存较长时间的话,推荐在-20下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收,从而影响检测结果,若经常使用可将试剂存放在4冰箱内保存。

24.
预培养后,更换培养基需要细胞计数吗?

一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数盘计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话,可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。

25.CCK-8
对于不同的细胞,灵敏度是否一样?

不一样,悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

26.
悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别?

悬浮细胞由于染色比较困那,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。

27.
应该每次做标准曲线吗?

建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样,对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样,灵敏度可能会有轻微的差异,对于不同的批号建议分别做标准曲线。

28.
有时在药物作用情况下,细胞已经死亡,但是脱氢酶的活性还在,是否能计算细胞数量?

不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量,如果细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,则试剂测定的细胞数量将会比真实值高,不能真实反映活细胞数量,建议采用别的方法测定。

29.实验之前,是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应?

建议使用一个孔作一下检测,因为有培养基中可能含有化还原反应的物质,在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。


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