植物组织中蔗糖酶活力的测定

了解植物组织中提取蔗糖酶的方法，掌握 Nelson 方法测定蔗糖酶活力的原理。

原理

植物组织中蔗糖酶活力的测定的基本原理是蔗糖酶可将非还原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖作为还原糖含有的 自由醛基，在碱性溶液中将 Cu2 +还原, 还原糖本身被氧化成羟酸。碑铜酸试剂与氧化亚铜生 成蓝色复合物（碑铝蓝），在 510 nm 波长下吸收峰与还原糖浓度呈正比，从而确定蔗糖酶的活 力，该法测定的范围为 25〜200 昭。

材料与仪器

材料: 植物叶片。

器材：分光光度计，刻度具塞试管，恒温水浴，移液管。

试剂：

①4 mmol • L- 1 葡萄糖溶液 20 mL

②4 mmol • L -1 蔗糖溶液 20 mL

③0. 5 mmol • L-1 蔗糖溶液 200 mL

④0. 2 mol • L-1 乙酸缓冲液（pH 4.5）200 mL

Nelson 试剂：

⑤A 试剂：100 mL 溶剂中含 Na2CO3 2.5 g,NaHCO3 2.0 g,Na2SO4 20 g, 酒石酸钾钠 20 g。

⑥B 试剂：100 mL 溶剂中含 CuSO. - 5 H2O 15 g, 浓 H2SO4 2 滴。以 A : B=50 : 2 的比例混合即可使用，使用前需在 37 °C 以上溶解，防止溶质析出。

⑦碑钳酸试剂：100 mL 中含钥酸铉 5 g, 浓 H2SO4 4. 2 mL, 碑酸钠 0. 6 g。

步骤

植物组织中蔗糖酶活力的测定的基本过程可分为如下几步：

1 . 标准曲线制作：

（1）取 9 支具塞试管，按表 49-1 加样。

表 49-1 标准曲线制作加样表 mL

（2）向每管中加 1 mL Nelson 试剂，盖上塞子，置沸水浴中 20 min。冷至室温，向每管中加 1 mL 碑钥酸试剂。

(3)5 min 后，向每管中加 7 mL 蒸馋水，混匀。

(4) 在 510 nmT 测定光密度，以还原糖葡萄糖为横坐标，以 ODs。响值为纵坐标，制作标 准曲线。

2. 酶活力测定：取 2 g 小麦苗，加入 2 mL 乙酸缓冲液，在冰浴中用研钵研磨成糊状， 12 000 r- min 1 离心 10 min, 留取上清液用于酶活测定。取 2 支具塞刻度试管，向每个试管 中加入乙酸缓冲液 0.8 mL,0. 5 mmol - 蔗糖溶液 0.2 mL, 适当稀释的酶液 1 mL, 以同 样处理但不加酶液者为空白对照，室温下放置 10 mino 然后向每管中加 1 mL Nelson 试剂， 置沸水浴中 20 min。冷却至室温，向每管中加 1 mL 碑钥酸试剂，5 min 后，向每管中加 7 mL 蒸馅水，510 nmT 比色，测定光密度 OD 沁 nm。

3. 结果计算：在室温、pH 为 4.5 的条件下，每分钟水解产生 1 日 mol 葡萄糖所需的酶量定 义为酶的 1 个活力单位 (U)。

蔗糖酶活力 (U・g— 1 . T、测得还原糖含量 XnXVXl 000

5 )— WXt式中：〃一稀释倍数；

V—酶液的总体积，mL；

W 一样品重，g；

t 一时间,10 min；

1 000—毫摩尔换算为微摩尔的倍数。

注意事项

1. 酶液的提取过程要尽量在低温条件下进行。

2. 配制葡萄糖标准液时，葡萄糖应在恒温干燥箱中 80°C 下干燥至恒重。