简并寡核苷酸引物 PCR

简并寡核苷酸引物 PCR，是用一条部分随机的引物对模板基因组 DNA 进行两步 PCR 扩增。

简并寡核苷酸引物 PCR 的基本原理是 DOP-PCR 用一条部分随机的引物对模板基因组 DNA 进行两步 PCR 扩增。简并寡核苷酸引物的序列为 5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3'，3' 端的 ATGTGG 序列是基因组 DNA 中分布频率极高的短序列，在第一步低温退火时起引导作用，也就是说扩增的起始位点由这 6 个特异的碱基决定，退火有一定序列倾向性。

这种在靶基因特异位点开始的扩增优于随机位点开始的扩增，可以降低扩增结果的复杂程度。中间 6 个简并碱基可以生成 46 种不同的序列，简并碱基中 1 个或多个碱基与 3' 端特异碱基一起在退火过程和模板 DNA 同时复性，加固引物与模板 DNA 的结合作用；5' 端的序列则是用于末端修饰，包括用于克隆的酶切位点。

扩增反应分两步进行：最初几个循环（3~5 个）在低退火温度（如 30 °C）下退火，使引物在模板 DNA 全长范围内随机退火并对模板 DNA 进行低严紧扩增；第二步则将退火温度升高至 62 ℃ 特异性退火，如同常规 PCR 进行 25~35 个循环，对第一步低严紧扩增产物进行放大。

DOP-PCR 扩增 效率高，扩增片段的长度大小在 300 bp-1.7 kb，平均 500 bp 左右，DOP-PCR 的扩增效率主要依赖于引物的浓度和聚合酶的活性。在低退火温度条件下，引物能与多个基因组位点（人类基因组可以达到 106）结合，扩增产物几乎覆盖全部基因组，是 WGA 中最具代表性的方法之一。

器材：PCR 仪

试剂：

① MgCl2：2 mmol/L；

② Tris-HCl：10 mmol/L pH 8.4；

③ KC1：50 mmol/L；

④ 引物（5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG_3'）2 mmol/L；dNTP：0.2 mmol/L；

⑤ Tag DNA 聚合酶：1.25 U/50 μl；

⑥ 基因组模板 DNA。

简并寡核苷酸引物 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（1）反应体系：MgCl2：2 mmol/L； Tris-HCl：10 mmol/L pH 8.4；KCl：50 mmol/L；引物（5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG_3'）：2 mmol/L；dNTP：0.2 mmol/L；Tag DNA 聚合酶：1.25 U/50 μl；基因组模板 DNA。

（2）扩增条件：第一轮低严紧扩增：95 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 1 min；30 ℃ 复性 1.5 min；3 min 内将温度从 30 ℃ 升高到 72 ℃，72 ℃ 延伸 3 min，进行 5 个循环。第二轮特异性扩增：94 ℃ 变性 1 min；62 ℃ 复性 1 min；72 °C 延伸 3 min（每个循环另加 1 s），进行 25~35 个循环。

① DOP-PCR 的扩增效率依赖于引物和聚合酶的浓度，但引物浓度太高易导致引物自连序列和非模板相关序列的形成。

② Taq DNA 聚合酶具有较高的突变率，使 DOP-PCR 产物中有较高的变异发生。引入高保真酶有助于提高产物的保真度。具有 3'→ 5' 外切酶校正活性的 DNA 聚合酶如 Pwo（expand high fi_x001F_delity fystem，roche）和 Taq 聚合酶的混合物已用于 WGA 扩增。

③ DOP-PCR 引物并非完全随机，3' 端的 6 个特异性碱基使基因组扩增有一定的倾向性，这种倾向性影响 DOP-PCR 对基因组的覆盖。但是增加 3' 端特异性碱基的数目（如增加到 8 个）降低 DOP-PCR 产物的复杂程度，同时使扩增产物具有一定的特异性。因此可通过增加 3' 端特异性碱基的数目来预计某些基因位点将得到扩增。

④ 基因组模板 DNA 量太少（＜10 pg）时，DOP-PCR 扩增的均匀性下降，基因组中很大部分将得不到扩增，出现等位基因选择性扩增或等位基因缺失、微卫星长度改变等人为假象，不能如实反映基因组的全貌。当样品中含有 5~10 个细胞 DNA 时（基因组 DNA>50pg），DOP-PCR 能为比较基因组杂交（comparative genome hybridization，CGH）提供合适的探针，但不适于染色体作图和微卫星分析。激光显微切割可能有助于 DOP-PCR 和 CGH 用 10~20 个细胞对微卫星进行分析。以诊断为目的时应该尽量增加原始模板的量，分别进行多次独立检测并使用高保真的 DNA 聚合酶。

⑤ DOP-PCR 扩增片段的长度大小在 300 bp-1.7 kb，平均 500 bp 左右。通过使用具有 3'→5' 外切酶校正活性的 DNA 聚合酶 Pwo 和延长复性、延伸时间可以获得 10 kb 的长片段产物，为后续的 PCR 提供可信度更高的模板，使后续 PCR 可以获得大于 1 kb 的特异基因产物。

⑥ 苏木素-伊红（haematoxylinYosin，HE）染色标本不适于 DOP-PCR，高浓度的苏木素降低 DOP-PCR 产物的质量，因此进行 DOP-PCR 扩增的微切割组织应避免用 HE 染色。对于浸润型肿瘤如少胶质细胞瘤组织常与正常组织交织混杂，组织微切割有助于获得相对一致的肿瘤细胞，DOP-PCR 与 CGH 对微切割组织的分析有助于揭示肿瘤细胞的真正细胞遗传学特征。