硝酸还原酶活力测定（活体法）-磺胺比色法

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·g-1·h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。

材料与仪器

作物叶片
亚硝酸钠标准液 磷酸缓冲液 对-氨基苯磺酸溶液 α-萘胺溶液 三氯乙酸溶液 异丙醇 磷酸缓冲液 KNO3
分光光度计 真空抽气泵 天平 单面刀片 保温箱 刻度试管 移液管

步骤

1. 标准曲线制作

取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。

表13-1  各试剂加入顺序

2. 酶反应和酶活性测定

（1）取样：将材料（小麦、玉米等作物叶片）洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干。在叶片中部打取直径1cm的圆片（或剪成0.5——1.0cm2的小块），混匀后每个样品称0.5——1.0g 3份，放入试管并编号。

（2）反应：向各试管加入KNO3·异丙醇·磷酸缓冲液混合液9ml，其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混匀作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30℃下于黑暗处保温30min，分别向处理管加1.0ml三氯乙酸，摇匀终止酶活性。

（3）比色：将各试管静置2min，吸取上清液2ml加入另一组试管，以对照管做参比，按标准曲线做法进行显色测定，并计算酶活性（Nμg·g-1·h-1）。

式中  C：反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg）；

V1：提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；

V2：酶反应时加入的粗酶液体积（ml）；

W：样品重量（g）；

t：反应时间（h）。

注意事项

磺胺比色法比较灵敏，显色速度易受温度，酸度等因素的影响，因此要严格控制实验条件，标准液与样品反应液同时反应、比色。

常见问题

硝酸还原酶活性的测定方法主要有离体法和活体法,又分别称为离体法和活体法。离体法操作手续繁杂、要求条件较高;体内法简便、快速,采用渐多。活体法存在NRA 测定值偏低、重复性不够理想的缺点,因而需要针对不同的测定材料,对活体法做进一步的探讨,确定最佳的测定条件。