表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用
简介
表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用是由于扩增这段位点可以用于检测相应疾病而且具有特异性的一种方法。
原理
表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是需要发现某个病原体的特异表位，再找出该特异表位相对应的DNA序列，然后就可用常规PCR方法把编码特异表位的DNA扩增出来而达到对某病原体的诊断。
用途
表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用可用于依赖于某一病原体的特异表位，如果能够知道某-病原体的表位，就可使用常规PCR对其检测，特异性特别好。
以下是用引物LDS和LDK对从几个病人组织中分离的黑热病皮肤和内脏利什曼原虫等的DNA进行特异表位PCR的结果。如图12-2所示。本方法可以用于扩增各种相应疾病的特异免疫显性位点，可以很好地区分同源菌株或相似疾病的DNA,所以可以对精确的诊断和有效的治疗提供依据。
材料与仪器
试剂：
①10×PCR缓冲液
(0.1 mol/L Tris-Cl pH8. 8, 15 mmol/L MgCl2,
0. 5 mol/L KCl和1% Triton X 100)；
②待测的DNA模板；
③250 pmol/L dNTPs,
④10 pmol. 上游引物LDS；
⑤10 pmol 下游引物LDK；
⑥1. 0 U Taq DNA聚合酶；
⑦含0. 5 μg/ml EB的2% 琼脂糖凝胶。
步骤
表位特异PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本过程可分为如下几步：
A.配制PCR反应体系。
待检测的模板：1 μl(不少于0.5pg)；
dNTPs(2.5 mmol/L)：1 μl；
10× PCR缓冲液：2.5 μl；
上游引物LDS( 10 pmol)：1 μl；
下游引物LDK( 10 pmol)：1 μl；
ddH2O：18 μl；
Taq DNA聚合酶(1.0 U/μl)：0.5 μl；
总体积：25 μl。
B. 设置PCR反应程序。
95 ℃：5 min；
95 ℃：1 min；
Tm-10 ℃：1 min；
72 ℃：1 min；
72 ℃：10 min。
设置PCR循环次数为30个循环。
注意事项
这种PCR可以探测0.5 pg的模板DNA，如果将PCR扩增出的产物作为内在探针用2P标记后与转移到硝酸纤维素膜的DNA杂交，那么探测灵敏度可提高10倍，可探测0.05 pg的DNA。
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