纳升高通量 PCR

纳升高通量 PCR 是指将高通量的芯片技术与 PCR 技术结合在一起产生的一种新的方法，商用的 TaqMan® OpenArray™系统已将反应体系降至纳升，这对稀少样品的检测极为有利，并且在一张芯片上可以完成多达 3072 个反应，可以进行终点定量，也可以进行实时定量。

TaqMan® OpenArray™系统的基本原理是是在一块薄的不锈钢电极板（25 mmX75 mmX0. 3 mm）上以 48 个子阵，每个子阵 64 个通 孔的形式排列 3072 个通孔，每个子阵的间距为 4.5 mm, 与 384 孔板相同。每个通孔的直径和深度均为 300/m, 可容纳 33nl 反应体系。芯片表面经过专利的疏水处理，而通孔内壁是亲水且生物兼容的。液体通过表面张 力留于芯片通孔内，试验所需的引物被预先 脱水固化于通孔内壁。使用时将 TaqMan® OpenArray 384 孔样品平板中的 DNA 样品与 PCR master mix 混合。用自动上样仪将样品混合物加样到 TaqMan® OpenArra 严纳升高通量 PCR 芯片中。将芯片插入装满浸液的封箱工作站中，并用封箱胶水密封。在对应的热循环仪上进行循环，用 NT 成像仪成像，并分析数据。图解示意如下。

纳升高通量 PCR 芯片所需样品量小，仅 33nl, 但同批处理的样品数量大，可达 3072 个样 品，适用于大样本而且量稀少的样品的处理。另外，该芯片除了可以对 DNA 样品进行处理，还 可对 RNA 样品进行定量 PCR 口⑶。另外，该方法在菌落的大规模筛选中也可应用⑷。

器材：

热循环仪（推荐 MJ lower PTC-200）； NT 成像仪（Bio Eove Inc.）； TaqMan® OpenArrayW 自动上样仪。

试剂：

TaqMan® OpenArray™平板芯片；TaqMan® OpenArray™ 384 孔样品平板（内含待检样 品）；PCR Master Mix 含 0. 5% 甘油，1 % Pluronic F38（BASF）和 50ng/ul BSA；封箱胶水（环氧树脂）；浸液。

以 48 个血液样本的 SNP（single nucleotide polymorphism, 单核苷酸多态现象）分型为例，纳升高通量 PCR 的基本过程可分为如下几步：

①利用试剂盒 QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA）提取分离血液样本（384 孔板中）的 DNA, -20℃ 冻存或将微平板置于冰上。

②以唯一的数字或字母命名微平板的每一个孔，使 SNP 分型软件可以追踪每一个从微平板转移至纳升平板的样品。

③将含有 DNA 样品的微平板室温解冻，1000r/min 离心 1 min, 冰上放置。

④吸取 211ul PCR master mix（10% 多余量）。

⑤在微平板的 48 个孔中，每个孔加入 4ul PCR master mixD

⑥每个 DNA 样品吸取分别与 4ul PCR master mix 吹吸混匀。

⑦用铝箔盖住含有 DNA 样品的微平板，1000r/min 离心 1 min 以去除气泡。冰上使样品冷却。

⑧用钳状骨针铝箔，暴露要转移至纳升高通量 PCR 芯片的 48 个样品，自动上样仪将样品加至芯片透孔中。

⑨将芯片插入装满浸液（一种与 PCR 反应体系不混溶的全氟化液体）的封箱工作站中，以 UV 照射环氧树脂密封，防止反应体系在热循环中挥发。

⑩将密封好的芯片放入热循环仪，设定程序如下：91°C 预变性 10 min, 然后以 51°C 23s、 53. 5°C 30s. 54.5°C13s、97°C 22s、92°C 7s 进行 50 个循环。循环结束后保持在 20°C 直至芯片被 成像处理。

⑪用 NT 成像仪成像，并分析数据。

①PCR master mix 的体积应多余 10% , 防止吸头的误差。

②用 OpenArray 自动上样仪将样品混合物上样到 TaqMan® 0 卩 2 話口汕即平板芯片中时, 芯片与吸头末端形成液体三明治结构。但是液体不会沾湿芯 片表面，因为芯片的表面经过疏水化处理，液体会迅速、 精确地进入每一个经过亲水化处理的透孔。

③在 SNP 分型中，DNA 的量和质量会影响准确率。 如图 8-6 所示，在三组试验中（分别用三角、圆圈和方框 代表），DNA 的质量不同，每个反应中 DNA 的浓度在 0.01〜Ing 之间，可以看出不同浓度的准确率各有不同。 但是有些反应，如三角代表的一组，在 DNA 的浓度低至 0. Olng 时准确率仍高达 90%；而有些反应，如方框代表的 一组，在 DNA 的浓度达到 0. 15ng 时，准确率才能达到 90%, 而小于 0. 15ng 时准确率就会迅速下降，在 0. Olng 时准确率不到 70%。这种准确率的改变为杂合子和纯合子 的分离增加了难度。

④TaqMan 试验的再设计也会增加纳升平板芯片的效果。图 8-7 所示为 TaqMan SNP 分型的 两次试验，图（b）中的试验与图（a）相比在探针的 5』末端添加了一个单核苷酸。这个改动大大提 高了基因分型的效果。

30000r 30000r

图 8-7 通过引物探针的再设计增加基因分型的有效性
⑤引物可以使用软件 Primer3 设计或在引物库中筛选，引物的退火温度应在 60〜65C, 采 用退火温度最接近的引物对。引物序列的长度应在 18〜25 个核苷酸，（G+C）含量在 30%〜 60%。每一对引物都经过磷酸化处理，通过离子键与芯片内壁表面结合，直到 PCR 反应的开始。