荧光定量PCR技术在肿瘤研究

肿瘤是危害人类健康的一种疾病，它的恶性程度与预后判断主要依靠是否有转移和病理切片分期。随着分子生物学的迅猛发展，肿瘤研究领域的大量研究成果显示，肿瘤的发生、发展、治疗和预后与肿瘤细胞内部基因和肿瘤相关病毒有关。本文综述了荧光定量PCR技术的原理及其在肿瘤研究中的应用。

1、单管荧光定量PCR技术的原理

单管荧光定量PCR（fluorogenic quantitative PCR, FQ PCR）的反应体系中除了普通PCR所需的引物外，还有一条荧光探针，探针的5`端标记了荧光报告基团，3`端标记了荧光淬灭基团，当这条探针保持完整时，荧光淬灭基团抑制荧光报告基团发出荧光。PCR反应开始后，随着DNA链的延伸，Taq酶的5`-3`外切酶活性将荧光探针切断，荧光淬灭基团的作用消失，荧光报告基团就发出了荧光信号，荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。

2、FQ—PCR的优点

FQ—PCR技术是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，实验的整个过程只在加样时打开1次反应管，在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量，因此也有人称FQ-PCR为实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）。

其优点为：

①FQ-PCR解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题。

②避免了普通定量PCR操作过程中的污染，FQ-PCR只在加样时打开反应管1次。

③FQ-PCR操作简便、快捷、结果准确，不需要普通PCR扩增后进行电泳或放射自显影观察结果，方便了临床上应用。

④FQ-PCR可以对每一批扩增样本进行扩增效率的评价。对DNA做系列稀释，每个稀释浓度的DNA对数值与其Ct值做回归分析，PCR的扩增效率的计算方法为：效率=10-1/斜率。通过计算扩增效率可以对仪器、操作人员和试剂进行综合评定。

3、FQ-PCR在血液系统肿瘤中的应用

Jones CD（1）对FQ-PCR技术预测慢性髓性白血病（CML）病人的髓外增的有效性进行了评价。FQ-PCR方法检测372例临床标本和50例外周血标本p210和 p190 bcr-abl RNA 融合基因的转录水平，用看家基因对结果进行标准化，检测结果为特异性100%。敏感性研究显示，细胞系稀释到0.0001%时仍然可以检测到bcr-abl，重复性实验显示组间变异系数（CV）为12.3%，组内变异系数为13.8。实验结果显示FQ-PCR是一种非常可靠的监测bcr/abl阳性CML病人的方法。

荧光原位杂交（FISH）的结果显示10%-15%的CML病人bcr-abl杂合子缺失，这样的病人预后非常差。FQ-PCR方法可以鉴定CML病人杂合子亚单位上的微小缺失，这种微小的缺失难于用FISH方法分辨出来。Kolomietz（2）用FQ-PCR方法对25例预后差的病人进行检测，18例无微小缺失CML病人获相对较好的治疗效果。

Hughes等（3）将1106例CML病人随机分为imatinib(蛋白激酶抑制剂)治疗组和INF-a+卡铂治疗组，用FQ-PCR检测2个治疗组病人血液中bcr-abl的转录水平，结果显示imatinib治疗组12个月后bcr-abl的转录水平降低了3个数量级，治疗效果明显优于INF-a+卡铂治疗组。CML病人bcr/abl的转录水平降低了3个数量级或无转录者，预后较好。

4、FQ-PCR在乳腺癌中的应用

Weigelt等（4）用FQ-PCR方法检测94例乳腺癌转移的病人外周血CK19、p1B、PS2 和 EGP2的mRNA水平，通过QDA将4个基因综合成一个评价指标。在77例乳腺癌骨转移的病例中发现QDA阴性病人的存活率明显高于QDA阳性病人(P=0.015 、0.0053)，QDA阳性的病人1年存活率为3%，2年的总存活率为17%，而QDA阴性的病人存活率为36%。

ANG1 和ANG2是肿瘤细胞分泌的促进肿瘤细胞生长和转移的因子，Sfiligoi（5）研究了ANG与肿瘤细胞淋巴结转移和肿瘤病人的生存率之间的关系。38例乳腺癌活检标本提取mRNA,用FQ-PCR技术测定ANG1 和ANG2基因水平，检测结果与临床病理和临床生化指标相比较，发现ANG2与腋窝淋巴结转移有高度的相关性，单变量和多变量生存分析显示，ANG2 mRNA 水平与疾病（p < 0.0001）、总存活率(p < 0.0003)呈单因素高度相关性。

5、FQ-PCR在胃肠道肿瘤中的应用

胃癌手术后的腹膜播散是胃癌复发的常见原因。Ueno（6）对124例胃癌手术病人实施腹腔灌洗，FQ-PCR技术检测灌洗液中CEA水平，结果显示CEA的Ct值与肿瘤的侵犯深度、淋巴结的转移、血管转移、肿瘤分期、存活率有高度的相关性。CEA的Ct值预测肿瘤腹膜转移的敏感性为76.9%，特异性为67.7%，而细胞学检测的敏感性只有23.1%。这些实验数据显示，FQ-PCR技术检测灌洗液中CEA水平，对预后和诊断是否有腹膜转移是一个很好的指标。

alpha4GnT是一种糖苷转移酶，它只存在于胃癌细胞中，外周血中检测不到。Shimizu（7）对37例胃癌病人和23名健康人外周血alpha4GnT的mRNA进行荧光定量检测，胃癌病人的检出率为62.2%，而健康人未检测出阳性。令人振奋的是有5例早期胃癌病人，胃癌侵犯只局限在粘膜层，alpha4GnT的mRNA的检出率达到80%。慢性胃炎、胃幽门螺杆菌感染的良性病变的alpha4GnT mRNA水平明显低于胃癌病人。这些结果表明定量检测外周血中alpha4GnT的mRNA是对胃癌的一个很好的检测指标。

肝癌的早期发现对肝癌的治疗和预后非常重要，Chuma（8）对7个早期肝癌结节和7个进展期肝癌结节的12 600个基因进行了定量分析，发现95个基因可以区分早期肝癌和正常组织，92个基因可以区分早期肝癌和进展期肝癌，其中热休克蛋白70基因（HSP70）在早期肝癌结节中明显上调，与癌前病变组织、正常组织存在明显差异（p<0.001）。