双脱氧法DNA 测序常见问题

放射自显影片空白

DNA 聚合酶失活

标记物太旧

用对照引物、模板及试剂进行试验

试剂太旧

替换缺陷试剂

不正确或有缺陷的引物

不正确或有缺陷的模板,

曝光失误（如保留了保鲜膜，凝胶对着胶片的背面等

改正错误

整张放射自显影片太亮／标记物掺入不足

标记物太旧

采用新标记物

酶活性太低

采用新的酶制剂，在临用前才稀释并置于冰上

引物与模板复性不好

将引物复性温度最优化。如果选用双链模板，记住在复性前一定要碱变性

引物量不够

用对照DNA模板和引物进行试验，检测引

物的浓度。使用单链模板时需引物0.5

pmol, 双链模板需1 pmol

模板量不够

用对照DNA 模板和引物进行试验，用凝胶

检测模板浓度，每组反应用约0.5 pmol 模板DNA

曝光或放射自显影失误

重新曝光，必要时更换显影试剂移去保鲜膜

所有泳道背泉都较高

DNA 模板不纯

检查对照DNA 是否存在同样的问题。如没

有，重新制备新的模板；如果是双链模板，用RNA 酶A 处理，酚抽提，乙

醇沉淀；必要时，用CsCl 提纯

DNA

整个泳道中条带全部扩散或模糊

DNA 模板不纯

检查对照DNA 是否存在同样的问题．如没

有，重新制备新的模板。如果是双链模板，用RNA 酶A 处理，酚抽提，乙醇沉淀，必要时，用CsCl 提纯DNA

聚丙烯酰胺凝胶质量差

用高质量的试剂配制新的丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺及缓冲液。储液保存于4℃暗处

凝胶灌制后不久就使用

让凝胶聚合更长时间

凝胶中缓冲液的浓度与电泳槽中的浓度有差异

从同一1OX TBE 储液出发，配制凝胶及电泳液

样品煮沸过度

如果样品将在多块凝胶中加样．从反应混合物中分别取3 μl 小份样品加热并上样

样品在电泳前未经变性

95’C 水浴加热样品2~3 min

在太高温度下进行凝胶电泳

用温度计监测凝胶温度，保持在65°C 以下，必要时，在稍低的电压下电泳以保持低温

凝胶部分区域条带模糊

凝胶或凝胶上的塑料包装膜有皱纹

详见测序胶罐装方式

胶片没有与凝胶夹紧

在凝胶背面插入滤纸以填充X 射线片盒的多余空间，必要时，多用些夹子

在凝胶450~550核苷酸处的所有条带扭曲

样品中含有＞0.5 ％甘油

用不含甘油的稀释液稀释DNA 聚合酶

整块胶所有的4 条泳道上均同时出现条带

酶活性低

用新的酶制剂，临用前才用合适的稀释液或1X 测序缓冲液稀释

缓冲液或核苷酸混合物有误

配制新的混合物试剂

试剂被污染

配制新的试剂

条带间隔失常；条带丢失两、三个泳道的同一位置上同时出现条带，但仅见于特定区域

压缩（在凝胶电泳条件下新合成DNA链的二级结构所致）

整块凝胶上均见不只一个泳道的同一位置上出现条带

DNA 制剂中含有2 种不同的DNA 分子，这些分子产生重叠序列

重新从单菌落或单个噬斑中制备新的DNA

引物复性于模板的第二位点

调整引物／模板的比例及复性温度