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PCR

反向 PCR 实验

2024-05-14 PCR 加入收藏

简介反向 PCR 又称染色体缓移或染色体步移，可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知 DNA 片段的序列，并可将仅知部分序列的全长 cDNA 进行分子克隆，建

简介

反向 PCR 又称染色体缓移或染色体步移，可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知 DNA 片段的序列，并可将仅知部分序列的全长 cDNA 进行分子克隆，建立全长的 DNA 探针。反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区段相连接的未知染色体序列。

方法原理

反向 PCR 的基本原理是选择的引物虽然与核心 DNA 区两末端序列互补，但两引物 3 ’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA，然后用 DNA 连接酶连接成一个环状 DNA 分子，通过反向 PCR 扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状 DNA 片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上 DNA 片段序列的识别十分重要。

方法应用

反向 PCR 可用于：

（1）基因游走研究；

（2）转位因子研究；

（3）已知序列 DNA 旁侧病毒整合位点分析等研究。

材料与仪器

试剂：

T4 DNA 连接酶（T4 DNALigase）、引物、 EcoR I 、ddH2O、酚、氯仿、无水乙醇、乙酸钠

仪器：

PCR 仪、电泳仪、离心管、离心机、超净台、水浴锅

步骤

反向 PCR 的基本过程可分为如下几步：

一、限制性内切酶消化

选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组 DNA 定量。
根据 T-DNA 的左边界序列选择合适的酶切位点 EcoRI，BamHI 和 HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物 Z1，Z2，Z3 和 Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组 DNA，37℃ 过夜，电泳检测酶切效果。

二、回收 DNA

将酶切产物转到 1.5 ml 离心管中，用 ddH2O 洗涤干净，并稀释到 250 ul；
加入等体积的酚和氯仿（V：V = 1：1），涡旋混匀，室温静置 1 min；
最大速度（13 000 rpm）离心 1 min；
将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置 1 min；
最大速度（13 000 rpm）离心 2 min；
将上清移到另一管中，加入 2.5 倍体积的- 20℃ 预冷的无水乙醇，0.1 倍体积的 3 M 乙酸钠（pH = 5.2），轻轻振荡混匀，室温静置 5 min；
4℃ 最大速度（13000 rpm）离心 10～15 min；
弃上清，尽量除去管壁上的液体；
加入 1 ml - 20℃ 预冷的 70% 乙醇，轻轻颠倒几次。最大速度（13 000 rpm）离心 5 min；
除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20～40 ul ddH2O 溶解。- 20℃ 保存。