重叠延伸 PCR

OVERLAP PCR，也称重叠延伸 PCR，是指先将两个想要连在一起的序列记为 A、B，用一对具有互补末端（在原基因上选取使得引物 A2 的 5' 端引物与 B1 的 3' 段引物之间有 20 bp 左右的互补片段）的相反方向引物将原来序列上 P 出重叠互补的片段，再用原来的正常引物扩增具有互补片段的序列，从而使得这两个并不在一起的序列在退火时可以互补配对连接在一起。

用于连接两个编码蛋白的 DNA 片段（常见于融合蛋白的构建）或者一个启动子和一个基因，尤其是当两片段不适合用限制酶切和 DNA 连接酶，比如酶切位点不易寻找或者限制性内切酶不常用且很贵时。也可用于基因的定点突变/基因打靶敲除。

仪器：

① PCR 仪

② PCR 管

③ DNA 电泳仪

④ 凝胶成像仪

⑤ 1.5 mL EP 管

⑥ 枪头和移液器

试剂：

① 灭菌水

② 全式金 Fast Pfu DNA 聚合酶和 buffer

③ 两个基因 A、B 分别两端的引物（A1、A2；B1、B2）

④ 两个模板质粒 A 和 B

⑤ dNTP mix

⑥ DNA 纯化回收试剂盒

⑦ AE buffer

1）先用灭菌水将模板质粒浓度稀释为 50 ng/µL，各引物浓度稀释为 10 µM 并瞬离置于冰上备用；

2）分别用各自的引物对两个基因进行第一轮 PCR 扩增，产物进行柱回收，得到 A' 和 B' 中间片段，PCR 扩增条件为 95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1.5 min，共 35 个循环，72 ℃ 最后延伸 5 min。

3）第二轮 PCR：用中间片段 A' 和 B' 作为模板，将二者测浓度后等摩尔数加入，并使总量不超过 100 ng。引物只用 A1 和 B2，其他成分不变。首先根据 Tm 值上下 10 ℃ 设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用适宜的退火温度进行 PCR 扩增，扩增条件与步骤 2）相同。

4）将 PCR 产物进行核酸胶电泳以验证 P 出基因片段长度是否正确，如正确，切胶回收后转化测序。

关键点：引物设计，保证两对引物的 GC 含量以及 Tm 值相当，且 overlap 片段长短适宜。

一般来说，重叠部分越长，其重组效率越高以及实验前首先跑核酸胶确保两段基因本身质量很好，处于超螺旋状态，模板质粒和引物浓度要适宜，PCR P 不出来时可将退火温度降低至 Tm -10 ℃，因为退火温度越低，引物与模板质粒越容易结合。

1、第一轮 PCR 不能得到理想的单一条带：

引物设计有问题，错配位点影响大。退火温度不合适，需要做温度梯度以摸索合适的退火温度。

2、第二轮 PCR 不能得到比较单一的条带：

A1 和 B2 引物不能很好的扩增出融合后的长片段，检查这两条引物的设计是否合理。引物 B1 和 A2 之间的重合部分太短，可考虑加长重合区。

可以用一个变通的方法：加入两个独立片段 A' 和 B' 后，不加入引物，其他组分不变，进行 PCR 扩增 10 个循环，然后取出，冷却后加入引物 A1 和 B2，继续扩增 30 个循环左右。这样做