重叠延伸 PCR基本方案
原理重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR）由于采用具有互补末端的引物，使PCR产
原理
重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR）由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。
材料与仪器
基因样品
PCR扩增酶 扩增酶Buffer dNTP 引物
PCR仪
PCR扩增酶 扩增酶Buffer dNTP 引物
PCR仪
步骤
1. 以引物a/b进行pcr1。
2. 以引物c/d进行pcr2。
3. 引物b/c中引入了需要的限制性位点。
4. 混合二者pcr产物，混合以前最好回收一下。
5. 进行pcr延伸反应，只有右面这个可以延伸。
6. 以延伸反应的产物为模板，以a/d为引物进行pcr。
7. 产物即为所需最终产物。
注意事项
尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；
2. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
8. 重复实验，验证结果，慎下结论。
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