考马斯亮蓝测蛋白浓度步骤

1.准备试剂与器材

‌考马斯亮蓝G-250试剂‌：通常是将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL的95%乙醇中，再加入适量的85%磷酸，最后用蒸馏水稀释至1L。具体配比可能因实验需求而略有不同。

‌标准蛋白质溶液‌：常用牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白，配制成一定浓度的溶液，如1mg/mL或100μg/mL，用于制作标准曲线。

‌分光光度计‌：用于测定染色后溶液在595nm处的吸光度值。

‌试管、移液器、涡旋混匀器等‌：用于溶液的配制、混合和测定。

2.制作标准曲线

①配制不同浓度的标准蛋白溶液‌：取一系列洁净的试管，分别加入不同体积的标准蛋白溶液和蒸馏水，使各试管中蛋白浓度呈梯度分布。

‌②加入考马斯亮蓝G-250试剂‌：向各试管中加入等体积的考马斯亮蓝G-250试剂，并充分混匀。

‌③测定吸光度值‌：使用分光光度计，在595nm波长下测定各试管中溶液的吸光度值。

④绘制标准曲线‌：以标准蛋白溶液浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。通常，标准曲线应呈线性关系，以便后续计算待测蛋白浓度。

3.测定待测蛋白浓度

‌①稀释待测蛋白溶液‌：根据待测蛋白的预估浓度，将其稀释至适当范围，使测定值落在标准曲线的线性范围内。

②加入考马斯亮蓝G-250试剂‌：向稀释后的待测蛋白溶液中加入等体积的考马斯亮蓝G-250试剂，并充分混匀。

‌③测定吸光度值‌：同样使用分光光度计，在595nm波长下测定待测蛋白溶液的吸光度值。

‌④计算待测蛋白浓度‌：根据测得的吸光度值，对照标准曲线，即可计算出待测蛋白的浓度。

4.注意事项

‌⑴试剂配制‌：考马斯亮蓝G-250试剂的配制需准确，避免浓度过高或过低影响测定结果。

‌⑵溶液混合‌：在加入考马斯亮蓝G-250试剂后，应充分混匀溶液，确保染料与蛋白充分结合。

‌⑶测定时间‌：在加入试剂后，应在规定时间内完成测定，避免颜色变化导致测定结果不准确。

⑷仪器校准‌：使用分光光度计前，应进行仪器校准，确保测定结果的准确性。