从总 RNA 中除去基因组 DNA 实验
材料与仪器变性（甲醛)琼脂糖凝胶 琼脂糖 蒸馏水 甲醛 蒸馏水 乙醇 甲醛 MOPS 缓冲液 乙二胺四乙酸 MOPS 乙酸钠 酚 氯仿（3:1) 溶液 氯仿 液
材料与仪器
变性（甲醛)琼脂糖凝胶 琼脂糖 蒸馏水 甲醛 蒸馏水 乙醇 甲醛 MOPS 缓冲液 乙二胺四乙酸 MOPS 乙酸钠 酚 氯仿（3:1) 溶液 氯仿 液体酚 Tris-HCl 电泳缓冲液
离心机和转头 离心管 配胶板 微波炉
离心机和转头 离心管 配胶板 微波炉
步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
变性（甲醛)琼脂糖凝胶（配制过程见第 18步）
1g琼脂糖
83 ml 蒸馏水
12.3mol/L甲醛
蒸馏水
乙醇，100%
乙醇（70%), 用 DEPC 处理过的 H20 配制
12.3mol/L(37%) 甲醛,pH>4.0
10XMOPS 缓冲液
0.01mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)
0.2mol/LMOPS
0.05mol/L 乙酸钠
酚/氯仿（3:1) 溶液
10 ml 氯仿
30 ml 液体酚
10 mlTris-HCl，pH7.0
电泳缓冲液（见第18f. 步）
10 ml10XMOPS
用 900 ml 蒸馏水，稀释到 1X 浓度
2. 核酸和寡核苷酸
来自方案 1 的 RNA
3. 离心机和转头
Microfuge(推荐 MocroSpin24，SorvallInstruments，Wilmington，DE)
4. 专用设备
1.5 ml 离心管
配胶板
微波炉
5. 附加试剂
MessageClean DNA Removal Kit(GenHunter M601), 包括 10X 反应缓冲液、无 RNA酶的 DNA 酶 I(10U/ul)、3mol/L 乙酸钠、焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的 H20、RNA
点样混合液
二、方法
1. 用 DNA 酶 I 消化总 RNA
（1）如果必要，用 DEPC 处理过的 H20 稀释所需量（最多 50ug) 的待消化 RNA, 最大体积为 50ul。
（2）在一个 1.5 ml 的离心管中，按顺序加入下列成分（总反应体积为 56.7ul)。
总 RNA50ul
10X 反应缓冲液 5.7ul
DNA 酶 I(10U/ul)1.0ul
（3）轻柔地混匀，并在 37°C 温育 30 min。
2. 抽提和乙醇沉淀无 DNA 的 RNA
（4）在购买时提供的玻璃储存容器中，将苯酚晶体加热至 65°C 熔化，用来配制酚/氯仿溶液。
（5）将 30 ml 熔化的酚加到 10 ml 氯仿中，并混合均匀。
（6）加入 10 mlpH7.0 的 Tris-HCl，混匀，使其在使用前形成饱和相。
（7）在每个 DNA 酶 I 反应的 1.5 ml 离心管中，加 40ul 酚/氯仿溶液，涡旋混匀 30s。
（8）将溶液置于冰上 10 min。
（9）以最大转速 4°C 离心 5 min。
（10）收集上清液，将之转移到一个干净的、标记好的 1.5 ml 离心管中。
（11）加入 5ul3mol/L 乙酸钠和 200ul 100% 乙醇，混匀。
（12）将混合液在-80°C 放置 lh 以上。
（13）以最大转速 4°C 离心 10 min，沉淀 RNA。
（14）小心地除去上清液，用 0.5 ml70% 乙醇（用DEPC 处理过的出 0配制）洗涤 RNA沉淀。不要将沉淀搅起。
（15）以最大转速 4°C 离心 5 min, 并除去上清液。再短暂离心一次，除去残留的液体，但不要搅动沉淀。
（16）用 10~20ulDEPC处理过的H2O 重新悬浮 RNA。
3.RNA 定置与完整性检测
（17）用蒸馏水将无 DNA 的 RNA 样品按 1:1000 稀释后，测定 OD260。
（18）按照下面的方案，制备变性（甲醛）琼脂糖凝胶。
a. 将下列成分加到可以在微波炉中使用的容器里。
10XMOPS 10 ml
琼脂糖 1g
蒸馏水 83 ml
b. 微波加热大约 3 min, 使琼脂糖熔化。
c. 将琼脂糖冷却至 50°C 以下。
d. 加入 7 mll2.3mol/L(37%)甲醛溶液，轻轻混匀。
e. 将胶倒入准备好的配胶板中，重新放好梳子。
f. 用 900 ml蒸馏水将 100 ml 10XMOPS 稀释成 1X 的浓度，制备电泳缓冲液（1L)。用电泳缓冲液将琼脂糖凝胶浸没。
（19）按照下面的方案，溶解 2~3ugDNA 酶消化前和消化后的 RNA 样品，与 RNA 点样混合液混合，在 7% 甲醛琼脂糖凝胶上检测 RNA 的完整性。
a. 取 1~10ul(2~3ug)RNA, 加到 20ulRNA 点样混合液中，在 1.5 ml 离心管中混匀。
b.65°C 温育10min。
c. 短暂离心，收集冷凝水。
d. 将样品放置冰上 5 min。
e. 将样品全部加到 RNA 胶上。
f. 以 50~60V 电压跑大约 45 min，或者到核糖体亚单位能够分辨为止。
（20）在变性胶上，核糖体亚单位会出现明显的条带。在提取或 DNA 酶处理过程中，被降解的 RNA 会呈现弥散的一片。所分析的生物不同，核糖体亚单位的大小也不同。
1. 缓冲液、溶液和试剂
变性（甲醛)琼脂糖凝胶（配制过程见第 18步）
1g琼脂糖
83 ml 蒸馏水
12.3mol/L甲醛
蒸馏水
乙醇，100%
乙醇（70%), 用 DEPC 处理过的 H20 配制
12.3mol/L(37%) 甲醛,pH>4.0
10XMOPS 缓冲液
0.01mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)
0.2mol/LMOPS
0.05mol/L 乙酸钠
酚/氯仿（3:1) 溶液
10 ml 氯仿
30 ml 液体酚
10 mlTris-HCl，pH7.0
电泳缓冲液（见第18f. 步）
10 ml10XMOPS
用 900 ml 蒸馏水，稀释到 1X 浓度
2. 核酸和寡核苷酸
来自方案 1 的 RNA
3. 离心机和转头
Microfuge(推荐 MocroSpin24，SorvallInstruments，Wilmington，DE)
4. 专用设备
1.5 ml 离心管
配胶板
微波炉
5. 附加试剂
MessageClean DNA Removal Kit(GenHunter M601), 包括 10X 反应缓冲液、无 RNA酶的 DNA 酶 I(10U/ul)、3mol/L 乙酸钠、焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的 H20、RNA
点样混合液
二、方法
1. 用 DNA 酶 I 消化总 RNA
（1）如果必要，用 DEPC 处理过的 H20 稀释所需量（最多 50ug) 的待消化 RNA, 最大体积为 50ul。
（2）在一个 1.5 ml 的离心管中，按顺序加入下列成分（总反应体积为 56.7ul)。
总 RNA50ul
10X 反应缓冲液 5.7ul
DNA 酶 I(10U/ul)1.0ul
（3）轻柔地混匀，并在 37°C 温育 30 min。
2. 抽提和乙醇沉淀无 DNA 的 RNA
（4）在购买时提供的玻璃储存容器中，将苯酚晶体加热至 65°C 熔化，用来配制酚/氯仿溶液。
（5）将 30 ml 熔化的酚加到 10 ml 氯仿中，并混合均匀。
（6）加入 10 mlpH7.0 的 Tris-HCl，混匀，使其在使用前形成饱和相。
（7）在每个 DNA 酶 I 反应的 1.5 ml 离心管中，加 40ul 酚/氯仿溶液，涡旋混匀 30s。
（8）将溶液置于冰上 10 min。
（9）以最大转速 4°C 离心 5 min。
（10）收集上清液，将之转移到一个干净的、标记好的 1.5 ml 离心管中。
（11）加入 5ul3mol/L 乙酸钠和 200ul 100% 乙醇，混匀。
（12）将混合液在-80°C 放置 lh 以上。
（13）以最大转速 4°C 离心 10 min，沉淀 RNA。
（14）小心地除去上清液，用 0.5 ml70% 乙醇（用DEPC 处理过的出 0配制）洗涤 RNA沉淀。不要将沉淀搅起。
（15）以最大转速 4°C 离心 5 min, 并除去上清液。再短暂离心一次，除去残留的液体，但不要搅动沉淀。
（16）用 10~20ulDEPC处理过的H2O 重新悬浮 RNA。
3.RNA 定置与完整性检测
（17）用蒸馏水将无 DNA 的 RNA 样品按 1:1000 稀释后，测定 OD260。
（18）按照下面的方案，制备变性（甲醛）琼脂糖凝胶。
a. 将下列成分加到可以在微波炉中使用的容器里。
10XMOPS 10 ml
琼脂糖 1g
蒸馏水 83 ml
b. 微波加热大约 3 min, 使琼脂糖熔化。
c. 将琼脂糖冷却至 50°C 以下。
d. 加入 7 mll2.3mol/L(37%)甲醛溶液，轻轻混匀。
e. 将胶倒入准备好的配胶板中，重新放好梳子。
f. 用 900 ml蒸馏水将 100 ml 10XMOPS 稀释成 1X 的浓度，制备电泳缓冲液（1L)。用电泳缓冲液将琼脂糖凝胶浸没。
（19）按照下面的方案，溶解 2~3ugDNA 酶消化前和消化后的 RNA 样品，与 RNA 点样混合液混合，在 7% 甲醛琼脂糖凝胶上检测 RNA 的完整性。
a. 取 1~10ul(2~3ug)RNA, 加到 20ulRNA 点样混合液中，在 1.5 ml 离心管中混匀。
b.65°C 温育10min。
c. 短暂离心，收集冷凝水。
d. 将样品放置冰上 5 min。
e. 将样品全部加到 RNA 胶上。
f. 以 50~60V 电压跑大约 45 min，或者到核糖体亚单位能够分辨为止。
（20）在变性胶上，核糖体亚单位会出现明显的条带。在提取或 DNA 酶处理过程中，被降解的 RNA 会呈现弥散的一片。所分析的生物不同，核糖体亚单位的大小也不同。
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