定 量 P C R

定量PCR 定义 以参照物为标准对PCR终产物进行分析或对PCR过程的进行监测，来评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR相对定量→绝对定量， 手工操作→自动化检测， 灵敏度与特异性多有很大的提高。 定量PCR的可行性 定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 特定的待扩增基因片段 起始含量越大，则指数扩增过程越短 当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，扩增片段的含量通常是一样的。 理想的扩增结果：Y=A×2n Y为扩增产物量 A代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数 理论上PCR扩增效率应为100%，PCR产物随着循环的进行成指数形成增长 实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2倍增长。 Y= A（1+R）n R 代表扩增效率： R = 参与复制的模板/总模板 R在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。 A 在 1～105拷贝,循环次数n≤20次：R 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析 随着循环次数n的增加（>20次），R值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期 PCR反应的后期：PCR产物的指数形式增长→线性增长→平台效应 控制： 原始模板的浓度范围 循环次数 通过PCR产物量计算原始模板量是完全可行的。 分类 根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为四种方法： ①有限稀释法，即倍比稀释法； ②使用外参照物的定量PCR ③使用非竞争性内参照物的定量PCR ④使用竞争性内参照物的定量PCR 根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类以及最后检测的信号的不同可分为四种类型： ①直接定量检测法， ②同位素标记定量检测法， ③酶标记定量检测法 ④荧光定量PCR技术 PCR过程的监测检测模式 （1） R Green I 检测模式 （2） 水解探针模式 （3） 杂交探针模式 （1） R Green I 检测模式 温度循环为94～55～72℃三步法 只有引物，无探针 荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号 易产生非特异信号，且本底光较大。 （2） 水 解探针模式 （Taqman）Hydrolysis Probe 温度循环为94～60 ℃ 二步法 有引物 一个探针（引物对之间） 增加了检测信号的特异性 （3） 杂交探针模式 （Hybridization Probes） 温度循环为94～55～72 ℃ 三步法 有引物 二个相邻的特异探针（引物对之间） 一．对PCR产物的直接定量法 基本方法：通过测定样本的产物量，推测样本中起始靶分子的相当数量。对已知量的靶DNA作系列稀释，摸索出不同循环数不同稀释度的PCR产物含量，建立外源性标准作对照。 优点：简单，可作粗糙的定量分析。 缺点：不准确，影响因素多。 二．极限稀释法 原理： 通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止 设置已知浓度的参照品 根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数 利用最大稀释度来进行标本核酸的定量 注意点 ①PCR产物的最低可检测极限须有重复性。 ②对每个稀释度必须作多次PCR 一般先对模板 DNA作10倍连续稀释后作PCR，首先找到 PCR结果呈阴性的接近稀释点 ，然后再对各稀释度作系列的2倍稀释，每个稀释点作5次PCR。 ③必须严格控制污染 优点：不需要特殊设备。 缺点：扩增反应条件的标准化；严格注意污染，避免假阳性的产生。 原理：同样反应条件，同一试管内，用两对引物，同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标序列。通过比较两种序列的扩增产量可对靶序列定量。 方法： ① 设计并合成PCR扩增靶基因及无关基因的引物，优化引物配比的条件。 ② 在指数增长期实现对靶基因及一系列已知含量无关基因的PCR扩增。 ③ PCR产物琼脂糖凝胶电泳，EB染色。 ④ 电泳条带的紫外光下分析。 ⑤ 二者荧光强度相等管的DNA含量亦相等。 该方法只有当靶序列和内标序列以相同的量存在时，才能对两者相对定量； 对处于扩增指数期的PCR产物定量。 四．竞争性PCR法 原理：同样的反应条件，同一个试管，用同一对引物，同步扩增靶序列和内参照序列。靶基因的量可通过与产生相同产物的竞争物的量相比较而得到。其基本条件是靶序列和竞争性序列均用相同的引物以相同的效率扩增，两序列的初始化比值在整个反应过程中保持不变。 目的DNA 内参照DNA 变性（同一对引物） PCR 竞争性模板的设置： 通过改变克隆的靶基因的序列来设计竞争性模板 插入新的限制性酶切位点或使原来的酶切位点缺失 通过基因重组技术插入一个与特异性蛋白结合的DNA片段，或者使靶序列发生定点诱变 人工合成竞争性模板 竞争性模板设计目的：使其与靶基因的PCR扩增产物相区别（酶切、杂交、显色等） 竞争性定量PCR的分类： 根据竞争性模板与靶基因的PCR产物区别的方法可分为 杂交法 酶切法 改变竞争性模板的长度 （一）限制性内切酶切割法 竞争性模板的制备：通过定点诱变使靶基因中限制性内切酶的作用位点缺失或增加新的限制性内切酶的作用位点，然后将其克隆入pUC或pGEM中，得到竞争性内参标模板。 竞争性PCR扩增 对PCR产物作限制性内切酶的切割 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳，EB染色 设标准品系列对照。 结果判断: 紫外光下观察： 各泳道的电泳条带数及其荧光强度，与标准品作对照 找出靶基因与竞争性模板荧光强度相同的标准管 该标准管中靶基因的初始量与待测管中待测模板的初始模板数应相同。 （二）杂交检测法 竞争性模板的制备：通过定点诱变在靶基因序列中造成部分序列缺失或增加部分序列，作克隆及测序。 杂交探针的制备：针对该突变序列设计杂交探针，并进行标记（同位素，酶，地高辛等）。 待测样品的定量： 利用PCR扩增估计待测模板的浓度范围 调节其浓度（与竞争模板浓度相等或相近）作竞争性PCR 从标准曲线查其浓度。 （三）改变竞争性模板的长度 制备竞争模板：在两条引物结合区间内引入或缺失部分序列 靶基因与竞争性模板的PCR扩增产物的分子大小不同，在普通琼脂糖凝胶电泳中出现相互分离的条带。 优点：能有效地控制扩增效率的管间和样本间的误差，是一种灵敏度较高，能比较客观反映标本初始状态时核酸模板含量的方法。 缺点：可能有假阳性。扩增效率可能不同。竞争性模板的构建和试验需大量时间。 五 固相杂交酶免疫法 (PCR-ELISA) 生物素～引物 扩增 亲和素―生物素～DNA―探针DNA～Dig （包被） （杂交） -----抗Dig～POD ------ 底物显色 原理: 生物素标记引物，地高辛标记的探针 标有生物素PCR产物与地高辛标记的探针杂交 链酶亲和素固相包被 杂交双链的生物素基团与固相包被的链酶亲和素结合 基团与随后加入POD-抗Dig结合 POD作用底物呈色酶标仪检测，显示待测样品中核酸模板含量。 优点:灵敏度较高，特异性好，避免假阳性，结果准确可靠，且成本不高，有利于推广和普及 缺点 CR体系不同管之间不同的模板提取效率、逆转录效率和扩增效率等因素的影响，故酶标结果不能完全客观地表示模板含量;且酶免疫显色反应的线性测定范围狭窄。 六.微板核酸杂交(三明治杂交) 固相杂交酶联法+PCR极限稀释法 原理:特异性探针包被于微孔板内,与待测核酸产物进行杂交,再用一显色探针与待测核酸的另一区域进行杂交;将一定浓度的标准品计算直线回归方程及绘制标准曲线,根据待测样品显色的光密度值推算出该样品的核酸浓度 捕获探针DNA ― PCR DNA―酶标探针DNA （杂交） （杂交） ―底物显色 优点: 1)排除非特异性扩增所致假阳性 2)在一定浓度范围内核酸模板量与显色光密度值呈良好线形关系 3)信号检测方便 缺点: 存在扩增后的污染 七．荧光定量PCR 主要原理：荧光共振能量转移(FRET) 外来光源激发供体荧光染料发出荧光 当其发射波长与受体荧光染料的吸收波长部分重叠，且两者距离很近(约10～100埃)时：受体荧光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。 常用于技术有三种： FRET技术 分子信标技术 Taqman.技术。 FRET技术 (Ligthtcycler技术瑞土Roche公司) 采用了两条相邻荧光探针 供体探针，受体探针 供体荧光探针的5’端和受体荧光探针的3’端分别标记不同的荧光素分子 两探针与模板DNA链杂交时，相邻很近(约10～100埃)，借助于FRET原理，受体荧光素分子吸收供体荧光所传递的能量，其报告基团发出一定波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。 检测第二荧光信号 实时荧光定量PCR仪　　　　　　　　　　LightCyclerTM 分子信标技术 新型荧光标记核酸探针，它可以在DNA序列扩增的同时进行探针杂交并显示其过程。 分子信标技术可应用于实时定量PCR测定靶基因浓度。 Taqman技术 两条普通引物，一条荧光标记探针 荧光标记探针: 5端：信号基团（Reporter），单独存在时可以发光； 3端：抑制基团（Quencher）,其存在时可抑制信号基因的功能，不产生发光现象。 荧光PCR反应的实现 定量依据： 在PCR扩增特定基因时，反应体系中原始模板数愈多，到达平台期所需的循环数愈少；原始模板数愈少，到达平台期所需的循环次数愈多。 将不同浓度的原始模板数对PCR扩增到检测阈值所需的循环次数（Ct值）作图，便得到一个标准曲线 7700型定量PCR仪 Taq Man试剂盒（PE USA） 荧光定量PCR的过程 样品常规处理 → 加入反应管,设置阴,阳性对照 → PCR仪扩增 →电脑分析后给出结果 优点 准确定量,定量范围宽; 特异性强,克服了假阳性的主要来源; 操作快速,无须做梯度稀释,无须PCR后处理; 技术简单,安全. 缺点 设备昂贵，难以普及 八．免疫PCR 原理：与ELISA基本相似。不同处： 1）标记物：一段任意的DNA分子而不是酶； 2）操作过程：有PCR扩增及DNA检测过程，无酶显色过程。 免疫PCR主要由两个部分组成 第一部分类似于抗原、抗体反应的酶联免疫吸附试验(ELISA) 第二部分为PCR扩增与检测。 一般程序：酶标板内包被捕获抗原的抗体，加入待测抗原孵育后洗涤，加入DNA标记的检测抗体，孵育后洗涤，PCR扩增粘附在抗体/抗原复合物上的DNA分子，电泳显示结果。 反应层次： 抗体---待测抗原---抗体―蛋白A～亲和素--生物素～DNA---PCR---电泳 特点 ①具有抗原、抗体反应的特异性和PCR的高敏感度，灵敏度约比ELISA高10倍； ②极为敏感的抗原检测技术，适用于微量蛋白质的检测； ③能同时对�种抗原成分进行检测； ④可直接用于检测细胞表面的微量抗原； ⑤可分为直接免疫PCR与双抗体夹心免疫PCR； ⑥可进行自动化操作。 关键：如何将抗体与标记用DNA连接，建立抗原、抗体与DNA的量的对应关系，从而将抗原的检测转化为DNA的检测。 抗体与DNA连接 间接法 通常是通过亲和素为桥梁，将生物素化的抗体与生物素化DNA连接。 由于在检测过程中需加入亲和素和生物素化DNA，洗涤步骤繁琐。 ssDNA与抗体的直接连接 通过异双功能化学绞联剂制备DNA―抗体偶连物，ssDNA与抗体的Fc段连接。 该法不影响抗体活性，能避免间接法繁琐的洗涤步骤，而且能同时进行多种抗原的检测 人工合成的ssDNA的长度不能超过100bp. dsDNA与抗体的直接连接 比ssDNA与抗体的直接连接法更具优越性，dsDNA的长度可达几千个bp，dsDNA比ssDNA更稳定，更易进行荧光家以及其他非同位素的标记。 免疫PCR扩增产物的检测 早期:定性或半定量检测 凝胶电泳，EB染色， 近年:定量检测 同位素标记定量PCR技术 酶标记定量PCR技术 荧光定量PCR技术等。 优点：特异性强，敏感性高，不需特殊仪器 缺点：本底高，连接分子来源不便。 ①直接定量法 ②极限稀释法 ③内参照法 ④竞争性定量PCR ⑤微板杂交法 ⑥PCR-ELISA法 ⑦荧光定量PCR ⑧免疫PCR 九．生物芯片(Biochip) DNA芯片(DNA ChiP) 寡核苷酸微芯片(Oligonucleofide Microchip) 基因芯片(Genechip) DNA阵列(DNA Array) 生物芯片的研究及其技术开发 20世纪90年代初：美国Affymetrix公司的Steve Fodor博士决定将硅技术与生物学技术融合在一起，借助半导体技术进行DNA芯片的研究 生物芯片技术诊断原理 基本过程： 病人的血液或漱口水或羊水→提取DNA→荧光／核素标记→滴在基因芯片→与基因芯片上相对应的基因发生结合→扫描检测→计算机识别疾病的基因 芯片的面积只有指甲盖大小(1―2平方厘米)，将其嵌在一小块黑色胶片上，在上面铺上一层肉眼看不见的DNA纤维，即DNA小探针，将需要被检测的基因提取出来后，切成长短不一的片段，用荧光化学物标记，检测时将标记过的荧光物质加在芯片上，与芯片上的大量探针进行杂交，标记过的DNA受激光光束激发后发出荧光，荧光的强弱与探针杂交程度相关。 图像分析： 用荧光显微镜装置对片基进行扫描，计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析，通过特制软件对不同区域荧光信号在芯片上组成的谱型分析可得出DNA序列及其变化的情况。