竞争性 RT-PCR: 拷贝数的评估

双蒸水 RT-PCR 缓冲液 MMLV 逆转录酶 SUPERaseIN Taq DNA 聚合酶 总 RNA 随机引物 dNTP 混合物 基因特异的正向引物 基因特异的反向引物
PCR 仪 PCR 管

第一部分：单链 cDNA 的合成

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

去除 RNA 酶的双蒸水

10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl2)

2. 酶和酶缓冲液

MMLV 逆转录酶（100~200U/ul)

SUPERaseIN(20U/ul,Ambion)

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP 混合物（10 mmol/L, 包含所有四种 dNTP)

随机引物（50umol/L)

总 RNA(1~5ug)

4. 放射性复合物

竞争性 RNA 转录本，109 拷贝（见方案 4)

5. 实验器材

薄壁的 PCR 管

二、方法

1. 在冰上向薄壁的 PCR 管中加 2ul 的 50umol/L 随机引物，一管用于 RNA 样品，一管用于竞争性 RNA 转录本。

2. 加 1~5ug 总 RNA 到样品管（最大体积为 10ul)。

3. 加 109 个拷贝的竞争性 RNA 转录本到相应管中（最大体积为 10ul)。

4. 在每管中加入 4ul 的10mmol/LdNTP 混合物。

5. 用去除 RNA 酶的双蒸水把体积增加到 16ul。

6.70°C 加热 10min，变性二级结构，然后立即放在冰上。

7. 加 2ul 的 10XRT-PCR 缓冲液。

8. 加 1ul 的 20U/ulSUPERaseIN。

9. 加 1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆转录酶。

10.42°C 孵育 lh。

11.95°C 加热 10min 使逆转录踌失活。

12. 继续进行扩增反应，或-20°C 储存。

第二部分：PCR 扩增

这一方案中 PCR 扩增的宗旨与相对 RT-PCR 中描绘的相同（见方案 1)。方案设计包括6 个反应及额外的 10% 份额。这对于一个样品用 4 个稀释浓度的竞争子、1 个无竞争子的对照和 1 个无模板的对照是足够量的。

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

去除 RNA 酶的双蒸水

10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl2)

2. 酶和酶缓冲液

TaqDNA 聚合酶（5U/pl)

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四种 dNTP)

基因特异的正向引物（5umol/L)

基因特异的反向引物（5umol/L)

来自上述反转录反应的 cDNA

4. 放射性复合物

竞争性 RNA 反转录反应物（未稀释=5X107 拷贝/ul)

薄壁的 PCR 管

6. 专用仪器

可编程的 PCR 仪

二、方法

1.准备 PCR 反应混合物。

10XRT-PCR 缓冲液 35ul

10 mmol/LdNTP 混合物 28ul

5umol/L 基因特异的正向引物 14ul

5umol/L 基因特异的反向引物 14ul

5U/ulTaq DNA 聚合酶 1.75ul

去除 RNA 酶的双蒸水 236.25ul

2.平均在每个 PCR 管中加入 47ulPCR 反应混合物，共 6 管，分别标记 1~6, 在冰上操作。

3.加 2ul 准备好的模板 cDNA 到 1~5 号管中（见单链 cDNA 的合成）。

4.梯度稀释的反转录反应包含的竞争性 RNA 转录本如下。

未稀释：1ul 反转录混合物=5X107 拷贝/ul

稀释 102 倍：加 1ul 反转录混合物到 99ul 的 TE 缓冲液中=5X105 拷贝/ul

稀释 104 倍：加 1ul 的稀释 102 倍反转录混合物到 99ul 的 TE 缓冲液中=5X103/ul

稀释 106 倍：加 lul 的稀释 104 倍反转录混合物到 99ul 的 TE 缓冲液中=5X101/ul

5.加 1ul 未稀释的竞争子到 1 号管中，对应 5X107 拷贝/ul。

6.加 1ul 稀释 102 的竞争子到 2 号管中，对应 5X105 拷贝/ul。

7.加 1ul 稀释 104 的竞争子到 3 号管中，对应 5X103 拷贝/ul。

8.加 1ul 稀释 106的竞争子到 4 号管中，对应 5Xl01 拷贝/ul。

9.加 1ul 去除 RNA 酶的双蒸水到 5 号管中，作为无竞争子对照。

10.加 3ul 去除 RNA 酶的双蒸水到 6 号管中，作为无模板对照。

11.在适当的配有热盖的 PCR 仪（例如 GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBioSystems) 上运行 PCR 扩增。扩增程序如下。

94°C 30s

退火温度 30s

72°C 30s

30 个循环

12.在含有 1ul/ml 溴化乙锭的 2%~2.5% 的琼脂糖凝胶上检验实验结果。每个反应上样 5ul，结果以转录本的量和拷贝数来表示。由于设计时竞争子具有与目的基因同样的反应动力学，可以与目的基因共同扩增，而且在每个反应中样品和竞争子 PCR 产物的量可以直接比较。竞争子获得的 PCR 产物的强度与来自于内源 RNA 转录本的扩增相一致，同等强度代表 RNA 样品中存在的内源信息。竞争性定量 RT-PCR 实验的例子如图 13-6。



13. 为了对影响竞争子和外源转录本的反转录效率的变量进行控制，要做一个最终的RT-PCR 实验，在这个实验中样品 RNA 和竞争子 RNA 在同一个管中被反转录。使用的竞争子 RNA 的量要接近于在初始 RT-PCR 实验中所提出的量，如前所述做反转录、扩增。如前所述，与内源信息产生同样信号强度的竞争子 RNA 的量代表了样品中内源信息的量。