以磁珠为基础分离基因组 DNA 的实验方法

全血 口腔涂片或样品污染物 二硫苏糖酵 乙醇 异丙醇 裂解缓冲液
自动定位器 P250 盒装吸头 血液基因组高产量系 96 孔收集板 BiomekFX 自动机械工作平台 分离装置 传热板 储液器 微量吸头 离心架筐 加热块 磁分离架 DNAIQ系统

方法1:利用液体处理自动机械工作平台从20ul全血中进行基因组DNA的高产率分离

这个方法用于对在液体处理自动机械，如BiomekFX和Biomek2000实验自动工作平台（BeckmanCoulter)上安装的96孔板内的20ul血液样品进行处理。如果用单头的设备对单个板进行处理，所需的时间还不到lh。

将血液与去垢剂-促溶剂、裂解/结合缓冲液混合，既可以破坏细胞及其核膜，又可以使

蛋白质变性。释放出的DNA被吸附在裂解/结合缓冲液中的MagneSil顆粒表面，而粘有靶复合体的磁珠被外部磁场捕获到样品板孔的側面，随后裂解液作为废液而被去除。残留的污染物经下面的一系列洗涤过程被去除：首先用裂解/结合缓冲液，然后用盐洗涤液，最后用乙酵/盐洗涤液以除去最后残留的微董亚铁血红素。磁珠干燥后，在一个传热板上用TE缓冲液或水来洗脱DNA。

一、材料

1.特殊的设备

3台单位置的实验用自动定位器（BeckmanCoulter)

4套P250盒装吸头（BeckmanCoulter)

4X4位置实验用自动定位器（BeckmanCoulter)

96孔收集板（Promega,A9161或类似产品）

96孔吸头洗涤自动实验用定位器（BeckmanCoulter)

装有单舱和一个96孔移液器头的BiomekFX自动机械工作平台（BeckmanCoulter)

深孔MagnaBot96孔磁性分离装置（Promega)

深孔多孔板（Marsh,AB-0932[2.2ml]和AB-0787[1.2ml]或类似产品）

传热板（Promega,Z3271或类似产品）.

加热和冷却自动实验用定位器（BeckmanCoulter)

MagnaBot边条，l/8in(lin=2.54cm)(Promega)

回旋振荡式自动实验用定位器（BeckmanCoulter)

底部为锥形的96孔储液器（InnovativeMicroplates，S30014或类似产品）

吸头装卸自动实验用定位器（BeckmanCoulter)

2.其他

MagneSil血液基因组高产董系统（Promega;该系统包括乙酵洗海液、抗泡沫试剂、裂

解缓冲液、盐洗涤液、洗脱缓冲液和MagneSil顺磁性顆粒）

3.细胞和组织

全血、口腔涂片或样品污染物



二、方法

1.将400ul裂解缓冲液和40ulMagneSil顆粒加到200ul血样中，利用剧烈的机械混合裂解白细胞，并使释放出的DNA与磁性颗粒（PMP)结合。

2.用MagnaBot磁场捕获颗粒，弃去液体。

3.用360ul裂解缓冲液彻底洗涤PMP。

4.用MagnaBot磁场捕获顆粒，弃去液体。

5.用360ul盐缓冲液彻底洗涤PMP。

6.用MagnaBot磁场捕获顆粒，弃去液体。

7.重复步骤5和6，使盐洗涤的总次数达到2次。

8.用360ul乙醇洗涤缓冲液彻底洗涤PMP。

9.用MagnaBot磁场捕获顆粒，弃去液体。

10.重复步骤8和9，使乙酵洗涤缓冲液洗涤的总次数达到3次。

11.在一个加热块上干燥PMP以除去所有残留的乙醇洗涤缓冲液。

12.在80°C加热块上与210ul洗脱缓冲液剧烈混合以洗脱DNA。孔内温度约为65°C。

13.将洗脱出的DNA储存于-20°C。

方法2:从污染物和口腔涂片中分离基因组DNA的DNAIQ分离法

DNAIQ分离系统利用了一种崭新 的DNA分离方法。利用MagneSil化学可以对多种样品中一定量的DNA进行捕获和释放。颗粒有一定携带DNA的能力，若DNA过多则只能结合一定董 的核酸（图9-6)。因此，通常此方法用于分离约l00ngDNA的实验，而不必考虑样品量的大小。用 100ul 洗脱缓冲液洗脱 DNA 使其终浓度达到 lng/ul。结果由该方法分离到的 DNA 不需要进行纯化后的定量。图 9-7 给出了这个方案的流程。



一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

二硫苏糖酵（DTT)，lmol/L

乙醇，95%?100%

异丙醇

裂解缓冲液

确定使用裂解缓冲液的总量（表9-3)。毎100ul裂解缓冲液（随DNAIQ系统一起提供）中加入1ul 1moL/L的DTT，颠倒数次使其混合，标记已加有DTT并注明日期。裂解缓冲液在室溫下储存不得超过1个月。



2. 特殊设备

抗气溶胶的微量吸头

DNAIQ 离心架筐（Promega,V1221)

加热块

MagneSphere 技术磁分离架（Promega)

微量离心管，1.5 ml 圆锥形（Promega，V1231)

3. 其他

DNAIQ 系统（Promega; 该系统包括树脂、裂解缓冲液、2X 洗涤缓冲液和洗脱缓冲液）

微量离心管，1.5 ml(Promega，V1231)

二、方法

1. 将样品（见表 9-3) 置于 1.5 ml 微量离心管中。切记：推荐用量的树脂可捕获 DNA 的最大量约为 l00ng。

2. 加适量备好的裂解缓冲液，不同样品需用不同体积的裂解缓冲液，参见表 9-3 的第 2栏（裂解缓冲液 1) 以确定适合的用量。盖上管盖，将试管置于 95°C 加热块上放 30 min。对于小污斑，替代方法是将受污染材料置于一个装有 1.5 ml 微量离心管的 DNAIQ 离心柱内，并向柱内加入 100?150ul 裂解缓冲液。小心盖上管盖，95°C 加热 30 min#如果使用图 9-7 中所示的微量离心管和离心柱，那么绝大部分的缓冲液将会留在离心管内，继续进行第 4 步。若样品所需裂解缓冲液的体积超过150ul, 不宜使用该方法。

3. 从加热块上移去试管，将裂解缓冲液和样品转移到 1.5 ml 微量圆锥形离心管内的离心柱中。为得到最大量的污染物应将裂解缓冲液与受污染的基质一起离心，这一点很重要。

4. 在室温下以最大转速离心 2 min, 移去离心柱。

5. 高速涡旋振荡树脂储存瓶 l0s 使其彻底混合，将 7ul 树脂加到 DNA 溶液中，加树脂时要保持重悬状态以获得相同的结果。

6. 高速涡旋振荡样品/裂解缓冲液/树脂混合物 3s，室温下保温 5 min。

7. 高速涡旋振荡试管 2s, 将其置于磁架上将会立刻出现分离现象。

8. 小心移弃所有溶液，切勿破坏管侧面上的树脂。

9. 加入 100ul 裂解缓冲液，从磁架上移开试管，高速涡旋振荡 2s。

10. 将试管重新放置到磁架上，移弃全部裂解缓冲液。

11. 加入 100ul1X 洗涤缓冲液，从磁架上移开试管，高速涡旋振荡 2s。

12. 将试管重新放置到磁架上，移弃全部洗涤缓冲液。

13. 重复步骤 11 和 12 两次，以使总洗涤次数达到 3 次，最后一次洗涤后要移弃所有溶液。

14. 打开试管盖，在磁架上风干树脂 5 min。

15. 加入 l00ul 洗脱缓冲液。

16. 盖上管盖，高速涡旋振荡试管 2s, 将试管置于 65°C 5 min。

17. 从加热块上移开试管，高速涡旋振荡 2s 后，立即将试管置于磁架上。

18. 将溶液转移到新容器内，DNA 的浓度约为 1ng/ul，可以直接用于扩增反应。DNA 溶液可在 4°C短期储存，或在-20°C 或-70°C 长期储存。