Gateway 克隆（LR 反应）

Gateway 克隆属于高效大规模克隆系统，是利用载体上一系列特殊的酶，可以高效、方便、快速地将不同 DNA 序列拼接在一起，将目的基因克隆到受体上用于重组表达载体、RNA 干扰载体、报告基因载体等等。

Gateway 克隆原理基于不同酶的催化反应，能够快速、准确地完成 DNA 序列的切割、转录和接合。其中 LR 反应发生在入门载体的 attL 位点和目标载体的 attR 位点之间，该反应由 LR 克隆酶混合物催化，产生了两侧具有 attB 位点的目的 DNA 表达载体。

Gateway 克隆技术可以用于构建各种表达载体、RNA 干扰载体和报告基因载体等。通过 Gateway 技术，可以方便快捷地将多个基因片段组合成一个表达载体，从而实现对基因表达的调控、表达定位和功能研究等。

入门克隆、目标载体、TE 缓冲液、Invitrogen LR Clonase II 酶、LR Clonase II 酶、蛋白酶 K 溶液、氨苄青霉素、各种试管、离心机、涡旋仪、冰、培养皿、孔板等。

Gateway克隆（LR 反应）的操作流程如下：

1、在室温下将以下成分添加到 1.5 ml 试管中并混合：

入门克隆 1~7 µl（50~150 ng）

目标载体 1 µl（150 ng/µl）

TE 缓冲液 8 µl，pH 8.0

冰上融化 Invitrogen LR Clonase II 酶混合物约 2 分钟。将 LR Clonase II 酶混合物短暂涡旋两次（每次 2 秒）。

2、向每个样品（上述步骤 1）中加入 2 µl LR Clonase II 酶混合物，并通过短暂涡旋两次使其充分混合，并离心。

3、将 LR Clonase II 酶混合物储存至 –20 ℃ 或 –80 ℃。

4、25 ℃ 下孵育 1 小时。

5、向每个样品中加入 1 µl 蛋白酶 K 溶液以终止反应。短暂涡旋后在 37 °C 条件下孵育 10 分钟。

6、进行转化：类似 BP 反应实验流程，将 1 µl 的 pUC19 DNA（10 ng/ml）反应转化进 50 µl Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1 噬菌体抗性细胞中，在含有 100 µg/ml 卡那霉素的 LB 板上分别接种 20 µl 和 100 µl。(在 LB 平板上使用针对目标载体的合适选择标记物，通常为 100 μg/ml 氨苄青霉素）。

7、预期结果：如果将整个LR反应转化并铺板，则有效的 BP 重组反应将产生>5 000 个菌落。