GST pulldown实验步骤

GST标签蛋白的表达

  首先需要在目标蛋白上克隆GST标签，以便后续实验中使用。可以通过PCR扩增、限制性内切酶消化和连接、质粒转染等方法将GST标签与目标蛋白融合。融合蛋白的表达可以使用大肠杆菌等表达宿主，根据融合蛋白的大小和目的选择合适的表达载体和表达条件。

GST融合蛋白的纯化

  将GST融合蛋白表达至一定的浓度后，可进行蛋白质的纯化。GST融合蛋白的纯化可以使用GST树脂，将蛋白质加入含有GST树脂的层析柱中，再使用洗脱缓冲液进行洗脱。此时，GST融合蛋白会在GST树脂上发生亲和作用，从而实现纯化。纯化的GST融合蛋白可以通过SDS-PAGE凝胶电泳进行检测，检查其纯度和完整性。

靶蛋白的制备

  制备靶蛋白可以使用细胞质提取物、重组蛋白等样品。为了便于后续的GST pulldown实验，需要在靶蛋白上标记亲和标签，例如Flag标签、His标签等。标记的靶蛋白可以通过SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot检测，检查其纯度和标记效果。

GST pulldown实验

  将纯化的GST融合蛋白加入含有靶蛋白的细胞质提取物中，使其在一定的条件下相互作用，然后进行亲和层析分离，分离出与GST融合蛋白结合的复合物。